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1、实验 转氨基作用 纸 层 析 法 生化教研室 1Here comes your footer 验证肝脏内存在具有转氨基作用的酶 初步掌握纸层析的原理和方法 实验目的 2Here comes your footer 茚三酮显色原理 1 转氨基作用 2 层析原理 实验原理 3Here comes your footer 转氨基作用 在转氨酶的作用下 氨基酸的 NH2和 酮 酸的 C O相互转化 生成相应的 酮酸和 氨 基酸的过程 磷酸吡哆醛 实验原理 4Here comes your footer 最常见转氨酶 转氨基作用 GPT 谷丙转氨酶 glutamic pyruvic transamina
2、se GOT 谷草转氨酶 glutamic oxaloacetic transaminade 所有转氨酶的辅酶都是维生素B6的磷 酸酯 磷酸吡哆醛 实验原理 5Here comes your footer 谷丙转氨酶 丙酮酸 丙氨酸 R1氨基酸 R2酮酸 R1酮酸 R2氨基酸 PLP 酮戊二酸 谷氨酸 实验原理 6Here comes your footer 层析技术是近代生物化学最常用的分离技术之一 它是利用 混合物中各组分的理化性质 吸附力 分子形状和大小 分子极 性 分子亲和力 分配系数等 的差异 在两相运动中 不断地 进行交换 分配 吸附及解吸附等过程 可将各组分间的微小差 异经过相同
3、的重复过程而达到分离 无论哪种层析均由固定相和流动相组成 7Here comes your footer 用水饱和的 水 滤纸 有机溶剂 结合水 样品在固定相中的浓度 C固 样品在流动相中的浓度 C流 分配系数K 固定相 流动相 OH OH OH OH 滤纸 有机溶剂 实验原理 8Here comes your footer B O 迁移率 f A 点样点到斑点中心的距离 AB 点样点到溶剂前沿的距离 AO 实验原理 9Here comes your footer 迁移率Rf与分配系数K的关系 KKRfRf 增加增加 样品的移动速度样品的移动速度 减少减少 减少减少 减少减少减少 减少 C C
4、 固固 增加增加 增加增加增加增加 RfRf 与与 K K 呈呈 反反 比比 实验原理 10Here comes your footer COOH H C CH3 NH2 COOH H C CH2CH2COOH NH2 实验原理 谷氨酸 丙氨酸 KGlu KAla RfGlu RfKAla 11Here comes your footer 茚三酮 H2O 茚三酮水合物 氨基酸氨基酸 茚三酮显色反应 蓝紫色化合物 实验原理 12Here comes your footer 1 实验器材 培养皿 滤纸 匀浆器 试管 试管架 恒温水浴 锅 毛细管 移液管 喷雾器 剪刀 铅笔 格尺 2 实验试剂 1
5、0 01M pH7 4磷酸缓冲液 2 0 1M丙氨酸溶液 3 0 01M 酮戊二酸溶液 4 0 1M谷氨酸溶液 5 0 5 茚三酮溶液 6 水饱和的苯酚 实验仪器和试剂 13Here comes your footer 实验操作 实验操作 1 肝匀浆制备 提供转氨酶 3 纸层析 4 茚三酮显色 2 转氨基 丙氨酸 谷氨酸 实验操作 14Here comes your footer 1 肝匀浆制备 提供转氨酶 新鲜肝脏0 5g 4 5ml 0 01mol L pH7 4磷酸缓冲液 充分匀浆至 粉红色溶液 充分匀浆 食指抵住底部 匀 浆中指 食指 夹住十字柄部 15Here comes your
6、footer 实验操作 16Here comes your footer 2 转氨基 丙氨酸 谷氨酸 测定管对照管 肝匀浆液 45 水浴箱5分钟煮沸10分钟 冷却 0 5ml0 5ml 丙氨酸 0 5ml 0 5ml 酮戊二酸 0 5ml 0 5ml PH7 4磷酸盐缓冲液 0 5ml 0 5ml 45 保温30分钟45 保温30分钟 17Here comes your footer 3 纸 层 析 画线 点样 打孔 做灯芯 展层 1 测定管 2 丙氨酸 3 对照管 4 谷氨酸 点样点直径 0 5cm 一般 点3 5 滴 前一滴干后 才可点第二滴 18Here comes your foote
7、r 2cm 3cm 灯芯制作 灯芯要包实 包圆灯芯要包实 包圆 灯芯下的穗要剪细灯芯下的穗要剪细 19Here comes your footer 打孔时 不要用油笔 孔不要太大 打孔时 不要用油笔 孔不要太大 打孔时 不要用油笔 孔不要太大 灯芯要包实 包圆 灯芯下的穗要剪细 灯芯要包实 包圆 灯芯下的穗要剪细 灯芯插入小孔时 不要突出滤纸表面 灯芯插入小孔时 不要突出滤纸表面 20Here comes your footer 4 茚三酮显色 实验结果实验结果 烘干 喷液 烘干 显色 21Here comes your footer 测量点样原点到各氨基酸 层析斑点中心的距离 计算各 氨基酸
8、的 f值 实验结果 22Here comes your footer 实验结果 用铅笔画出条带的边框 测出表格中的数值 计算Rf 值 测测定参数 测测定样样品谷氨酸丙氨酸对对照 点样样点到斑纹纹中心 距离 cm 点样样点到溶剂剂前沿 距离 cm Rf 值值 与已知的标准的氨基酸Rf进行对比 指出条带所对应的氨 基酸 并根据结果解释转氨作用 23Here comes your footer 1 匀浆器的正确使用 2 对照管的煮沸时间要充分 3 手不要在滤纸上乱摸 4 点样量不可过多 点样过程中应注意不要造成滤 纸污染 手和唾液都含有氨基酸 点样点直径 0 5cm 一般 点3 5 滴 前一滴干后 才可点第二滴 5 在滤纸上划线时只需用铅笔 不可用其它笔 6 烘烤时要注意明火 7 点样时毛细管不能交叉污染 8 茚三酮的喷量要适中 注意事项 24Here comes your footer 1 如果对照管在沸水中煮的时间不够充分 会在层析结果中出现什么现象 2 比较谷氨酸和丙氨酸Rf值的大小 并说明 为什么 3 你的结果中有谷氨酸吗 为什么 实验讨论 25Here comes your footer
