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1、抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术 1 1 2 2 3 3 抗肿瘤药物药效学指导原则 细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究 技术指导原则 化学药物一般药理学研究技术指导原则 中药 天然药物一般药理学研究技术指导原则 指导原则 4 4 体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型 其中至 少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型 试验结果三种模型均为有效 再重复一次也为有效 体外实验选用10 15株人癌细胞株 至少重复一次 2 3 抗肿瘤药物药效学研究的要求 体内 体外实验方法相结合 以体内实验为主1 5 5 体外抗肿瘤活性试验 对候选化合物进行初步筛选 了解候选化合物的抗瘤谱 为随后进行的体内抗肿瘤试
2、验提供参考 试验试验 目 的 6 6 体外抗肿瘤活性试验 试验试验 方法 选用10 15株人癌细胞株 试验还应考察受试物对耐药肿瘤细胞系和正常人源细胞的作用和影 响 使用MTT还原法 磺酰罗丹明B SRB 染色法 药物与细胞共培养时间一般为48 72 小时 贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药 试验应设阴性 阳性 溶媒对照组 阳性对照用一定浓度的标准抗 肿瘤药 试验至少应重复一次 7 7 四氮唑盐还原法四氮唑盐还原法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理 试验原理 四氮唑四氮唑 MTT 3 4 5 dimethylibiazol 2 yl 2 5 diphenyl MTT 3 4 5 dimethyli
3、biazol 2 yl 2 5 diphenyl tetrazolium bromide tetrazolium bromide 是一种能接受氢原子的染料 活细胞线粒体中与是一种能接受氢原子的染料 活细胞线粒体中与NADPNADP 相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTTMTT转化成不溶性的蓝紫色的甲转化成不溶性的蓝紫色的甲 月替月替 formazan formazan 而死的细胞则无此功能 用二甲基亚讽 而死的细胞则无此功能 用二甲基亚讽 DMSO DMSO 溶解甲溶解甲 月替月替 后后 在一定波长下用酶标仪测定光密度值 即可定量测出细胞的存活率 在一定波长下用酶标
4、仪测定光密度值 即可定量测出细胞的存活率 方法要点 受试样品处理细胞结束后 加入方法要点 受试样品处理细胞结束后 加入5mg ml MTT5mg ml MTT液液2020微升微升 孔 继续孔 继续 培养四小时 再加三联液并培养过夜 在酶标仪上于培养四小时 再加三联液并培养过夜 在酶标仪上于490nm490nm波长处检测波长处检测ODOD 值 值 观测指标观测指标 直接指标为直接指标为9696孔板上各被测孔的孔板上各被测孔的ODOD值 然后按公式 对照组值 然后按公式 对照组ODOD 值值 治疗组治疗组ODOD值 值 对照组对照组ODOD值值 100 100 计算出相应的细胞生长抑制率 剧情计算
5、出相应的细胞生长抑制率 剧情 况可进一步采用况可进一步采用LogitLogit法计算法计算50 50 生长抑制浓度生长抑制浓度IC50IC50值 值 8 8 磺酰罗丹明染色法磺酰罗丹明染色法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理试验原理 SRB sulforhodamine SRB sulforhodamine 是一种蛋白质结合染料 粉红色 可溶于是一种蛋白质结合染料 粉红色 可溶于 水 水 SRBSRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合 其在可与生物大分子中的碱性氨基酸结合 其在515 nm515 nm波长的波长的ODOD读数读数 与细胞数呈良好的线性关系 故可用作细胞数的定量 与细胞数呈良好的线性关
6、系 故可用作细胞数的定量 MTTMTT法的一个缺点是法的一个缺点是 ODOD值可随放置时间而变 而值可随放置时间而变 而SRBSRB法无此现象 因此更适用于进行大规模的法无此现象 因此更适用于进行大规模的 试验 试验 方法要点方法要点 用用10 10 冷三氯乙酸与冷三氯乙酸与4 4 固定已经受试样品处理的细胞固定已经受试样品处理的细胞1h1h 洗涤 洗涤 干燥 加入 干燥 加入4mg ml SRB4mg ml SRB液液100100微升微升 孔孔 染色染色15min15min 1 1 冰醋酸洗涤 干燥冰醋酸洗涤 干燥 最后加入 最后加入150150微升微升 孔孔 的的TrisTris溶液 在酶
7、标仪上与溶液 在酶标仪上与515nm515nm波长处检测波长处检测ODOD值值 观测指标观测指标 同同MTTMTT法 另外 法 另外 NCINCI目前采用以下指标评价化合物的体外抗肿目前采用以下指标评价化合物的体外抗肿 瘤活性 测定的瘤活性 测定的ODOD值包括对照组 加药组及加药时的细胞的值包括对照组 加药组及加药时的细胞的ODOD值值C C T T 和和T0T0 据此计算 据此计算 生长抑制率 生长抑制率 T T T0T0 C T0C T0 100 100 按生长抑制率按生长抑制率 或细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图 并求出或细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图 并求出IC50IC
8、50 9 9 染料排斥法染料排斥法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理试验原理 活细胞有排斥某些染料如伊红 台盼蓝 苯胺黑等的能力 而死 活细胞有排斥某些染料如伊红 台盼蓝 苯胺黑等的能力 而死 细胞由于膜完整性的破坏 可被着色 因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料细胞由于膜完整性的破坏 可被着色 因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料 一定时间后 对着色和未着色的细胞进行计数 即可算出被杀死的细胞比 一定时间后 对着色和未着色的细胞进行计数 即可算出被杀死的细胞比 例 例 方法要点方法要点 向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液 最常用的是 向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液 最常用的是 0 4
9、 0 4 台盼蓝液 混匀 室温染色台盼蓝液 混匀 室温染色5 15min5 15min 将已染色的细胞悬液滴加至血细 将已染色的细胞悬液滴加至血细 胞计数板 直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数 胞计数板 直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数 观测指标观测指标 按 未染色细胞数 按 未染色细胞数 细胞总数 细胞总数 X100 X100 计算活细胞率 对照组活计算活细胞率 对照组活 细胞率应在细胞率应在90 90 以上 根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量 以上 根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量 LD50LD50 作为药物抗肿瘤活性的指标 作为药物抗肿瘤活性的指标 1010 阿拉马蓝法阿拉马
10、蓝法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理试验原理 非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内 非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内 的的NADPHNADPH相关的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物 采用微相关的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物 采用微 培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm530nm和和590nm590nm处读处读 取荧光强度值 与活细胞数呈良好的线性关系 取荧光强度值 与活细胞数呈良好的线性关系 方法要点方法要点 细胞经受试样品处理后 加入 细胞经受试样品处理后 加入10 20ul10 20ul阿拉马蓝染液 阿拉马蓝染液
11、继续培养一定时间 用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分继续培养一定时间 用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分 别为别为530nm530nm和和590nm590nm处读取荧光强度值 处读取荧光强度值 观测指标观测指标 根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率 适当时可进 根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率 适当时可进 一步计算一步计算IC50IC50值 值 1111 集落形成法集落形成法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理试验原理 克隆原细胞具有持续增殖能力 当单个细胞分裂 克隆原细胞具有持续增殖能力 当单个细胞分裂6 6代或代或6 6代以上时代以上时 其后代所组成的群体 其后代所组成的群体 集落集落
12、便含便含5050个以上细胞 通过集落计数可对克隆原个以上细胞 通过集落计数可对克隆原 细胞作定量分析 它反映了单个细胞的增殖潜力 故能较灵敏地测定抗癌药细胞作定量分析 它反映了单个细胞的增殖潜力 故能较灵敏地测定抗癌药 的活性 日前被认为是一种较理想的检测方法 的活性 日前被认为是一种较理想的检测方法 方法要点方法要点 将浓度为 将浓度为500500个细胞个细胞 ml ml的对数生长期细胞悬液的对数生长期细胞悬液2ml2ml种至种至35ml35ml的培的培 养皿 并加受试样品适量 培养养皿 并加受试样品适量 培养7d7d或更长时间 姬姆萨染色 解剖显微镜下或更长时间 姬姆萨染色 解剖显微镜下
13、计数含计数含5050细胞以上的集落 细胞以上的集落 观测指标观测指标 根据集落数计算集落形成率 对照组集落形成率不应低于 根据集落数计算集落形成率 对照组集落形成率不应低于40 40 再计算用药组的集落形成抑制率 根据情况可进一步采用再计算用药组的集落形成抑制率 根据情况可进一步采用LogitLogit法计算受试样法计算受试样 品的品的IC50IC50值 值 集落形成率集落形成率 集落数集落数 细胞接种数细胞接种数X100 X100 集落形成抑制率集落形成抑制率 1 1 用药组集落形成率 用药组集落形成率 对照组集落形成率对照组集落形成率X100 X100 1212 生长曲线测定法生长曲线测定
14、法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理试验原理 在最适条件下 肿瘤细胞在培养液中呈指数生长 如取细胞数的 在最适条件下 肿瘤细胞在培养液中呈指数生长 如取细胞数的 对数与培养时间作图可得一条直线 故称此时为对数生长期 随着细胞密度对数与培养时间作图可得一条直线 故称此时为对数生长期 随着细胞密度 不断增高 由于代谢产物的积聚及营养物的消耗 细胞生长逐渐减慢以致停不断增高 由于代谢产物的积聚及营养物的消耗 细胞生长逐渐减慢以致停 止 此时称高坪期或稳定期 因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反止 此时称高坪期或稳定期 因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反 映出来映出来 方法要点方法要点 将浓度为
15、将浓度为1000010000个细胞个细胞 ml ml的对数生长期细胞悬液按每瓶的对数生长期细胞悬液按每瓶5ml5ml种至种至 25ml25ml的培养瓶 或按每孔的培养瓶 或按每孔100100微升种至微升种至9696孔板 并加受试样品适量 培养后孔板 并加受试样品适量 培养后 分别于即刻和分别于即刻和1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7d7d进行检测 前者可采用台盼蓝染色计进行检测 前者可采用台盼蓝染色计 数活细胞 后者可采用数活细胞 后者可采用MTTMTT法或法或SRBSRB法读取法读取ODOD值 并据此进行作图与计算值 并据此进行作图与计算 观测指标观测指标 1 1 倍增时间
16、倍增时间 TD TD 将实际生在曲线进行直线回归求出将实际生在曲线进行直线回归求出0 0和和t t时刻的时刻的 理论细胞数理论细胞数N0N0和和N tN t 据此计算 据此计算 TD 0 301t TD 0 301t log N t log N0log N t log N0 2 2 增殖细增殖细 胞杀伤率 胞杀伤率 N0 N0 N0 100 N0 N0 N0 100 3 3 细胞生长饱和密度 细胞生长饱和密度 N sN s 代 代 表高坪期每毫升细胞数的均数 表高坪期每毫升细胞数的均数 1313 体外抗肿瘤活性试验 白血病 6株 CCRF CEM HL 60 K562 MOLT 4 RPMI 8226 SR 肺癌 9株 A549 EKVX HOP 62 HOP 92 NCI H23 NCI H226 NCI H322 MNCI H460 NCI H522 乳腺癌 BT 549 HS578T MCF 7 MCF 7 ADR MDA MB 231 ATCC MDA MB 435 MDA N T 47D 卵巢癌 IGROV1 OVCAR 3 OVCAR 4 OVCAR 5 OVCAR 8 S
