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1、1动态浊度法的建立及测定角膜真菌感染标本的初步研究*作者：刘宏伟，王香兰，彭淑玲，周 毅【摘要 】 目的 建立动态浊度法，研究角膜真菌感染的检测。方法 分别测定葡聚糖标准品、内毒素标准品、真菌标准株(烟曲菌、串珠镰刀菌和茄病镰刀菌)及细菌标准株( 绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌)，测定 19 例临床标本。结果 葡聚糖的浓度时间曲线为双曲线，时间反应曲线显示反应速率较低。内毒素的浓度时间曲线为直线，时间反应曲线显示反应速率较高。三种真菌的浓度时间曲线和时间反应曲线与葡聚糖的相似，革兰阴性菌（绿脓杆菌）的浓度时间曲线和时间反应曲线与内毒素的相似，革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌）没有反应。临床 19 例标本，
2、根据其浓度时间曲线和时间反应曲线的形态，11 例确诊为真菌感染，8 例为革兰阴性细菌曲线，为真菌和细菌的混合感染。结论 动态浊度法可用于角膜真菌感染的检测，但对细菌-真菌混合感染不能确诊。【关键词】 动态浊度法；真菌；角膜；葡聚糖2【Abstract】 Objective To establish the turbidimetric kinetic assay and study the measurement of fungus infection in corneal specimen.Methods Glucan， endotoxin， fungus(Aspergillus fumiga
3、tus， Fusariunmoniliforme and Fusariun solani) and bactiria(Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureaus) were measured. 19 clinic specimens were also measured.Results The concentration-time curve of glucan was hyperbolaand its time-reaction curve had low reaction rate. The concentration-time cu
4、rve of endotoxin was beeline and its time-reaction curve had high reaction rate. The concentration-time curve and time-reaction curve of 3 fungi were same as that of glucan. The concentration-time curve and time-reaction curve of G- bacterium(Pseudomonas aeruginosa) were as same as that of endotoxin
5、. The G+ bacterium(Staphylococcus aureaus) had no reaction. According the concentration-time curve and time-reaction curve， 11 specimens were diagnosed fungi and 8 specimens were co-infection of fungi and bacteria.Conclusion Fungi infection in cornea could be diagnosed by turbidimetric kinetic metho
6、d. Co-infection of fungi and bacteria could not be diagnosed by this method.3【Key words】 turbidimetric kinetic method；fungus；cornea；glucan角膜真菌感染的诊断较难，如不能及时治疗，对患者造成损害，因此快速诊断非常必要。真菌的诊断一般采用镜检和培养的方法，镜检较快，但漏检率较高，真菌培养的方法，检出率较高，但时间较长。我们使用鲎试剂与真菌的葡聚糖反应的原理，建立动态浊度法并对角膜标本进行真菌测定。1 材料与方法1.1 试剂 葡聚糖标准品(031222，规格：30
7、0g/ml)，鲎试剂（批号 040532，灵敏度： 0.25Eu/ml）购自厦门鲎试剂厂，内毒素标准品（批号 2002-7）和检测用水(批号 2003-3)购自中国药品生物制品检定所。1.2 仪器 BET-72 细菌内毒素测定仪、振荡器（天津大学无线电厂） ，超声波处理器、离心机（Beckman 公司） 。1.3 葡聚糖和内毒素的浓度- 时间曲线1.3.1 葡聚糖 将其倍比稀释为4100、 50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39 和 0.20g/ml，取其 200l 加入 100l 鲎试剂，振荡 30s，放入 BET-72 细菌内毒素测定仪测定，测定温度为(37
8、1)。1.3.2 内毒素 将其 10 倍稀释为 50、5 、0.5 、0.05 和0.005EU/ml，按上述方法测定。1.4 细菌、真菌标准株的测定 细菌包括革兰阴性菌(绿脓杆菌)和阳性菌(金黄色葡萄球菌) ，真菌包括烟曲菌、串珠镰刀菌和茄病镰刀菌。在培养基上取少量菌落，加入 1ml 检测用水，超声波处理min，2000cpm ，min，取上清。用检测用水将其按 10倍稀释，分别取 200l 加入 100l 鲎试剂，振荡 30s，BET-72 细菌内毒素测定仪测定。1.5 标本的处理 角膜标本来自北京普仁医院眼科，为临床确诊真菌性角膜炎后，进行角膜移植，将角膜标本用检测用水冲洗后，在洁净台中
9、将其剪碎，加入 1ml 检测用水超声波处理min，cpm，min，取上清备用。1.6 标本的测定和结果的确定 共检测临床诊断真菌的感染的角膜标本 19 例，标本处理后，用检测用水将其按 10 倍稀释 8 个稀释度，分别取 200l 加入 100l 鲎试剂，振荡 30s，放入 BET-72 细5菌内毒素测定仪测定。根据标本的浓度-时间曲线、时间反应曲线和时间速率曲线确定。1.7 BET-72 细菌内毒素测定仪的检测指标 内毒素或葡聚糖与鲎试剂中的 B、C 或 G 因子反应，形成凝胶，记录不同浓度的内毒素或葡聚糖在反应过程中不同时间的光密度值，确定 OD 值达到 0.02的反应时间为测定反应时间，
10、以反应时间为纵坐标，以药物浓度为横坐标，做图，成为浓度时间曲线。时间反应曲线为某一浓度的内毒素或葡聚糖在不同时间的 OD 值，以时间为横坐标，以样品的OD 值为纵坐标，做图。时间速率曲线为某一浓度的内毒素或葡聚糖在不同时间的反应速率，以时间为横坐标，以样品的反应速率为纵坐标，做图。2 结果2.1 葡聚糖的浓度时间曲线 葡聚糖的浓度时间曲线为双曲线（图 1） ，低浓度时，反应时间较长，随浓度的增加，反应时间减少，到达最低点后，反应时间随浓度的增高而增加。时间反应曲线显示，反应开始时，反应速率较低，曲线形态如“S” 型。时间速率曲线显示，不同浓度的葡聚糖的最大反应速率大部分在 10002000s
11、的时间范围内。6图 1 葡聚糖时间-浓度曲线2.2 内毒素的浓度时间曲线 内毒素的浓度时间曲线为直线（图2） ，反应时间随内毒素浓度的增高而减少。时间反应曲线显示，反应开始时，反应速率较高，曲线形态如同“倒 L”型。时间速率曲线显示，不同浓度内毒素的最大反应速率大部分在 5001000s 时间范围内。图 2 内毒素时间-浓度曲线2.3 真菌标准株的结果 烟曲菌、串珠镰刀菌和茄病镰刀菌的浓度时间曲线、时间反应曲线和时间速率曲线与葡聚糖的相似。2.4 细菌标准株的结果 绿脓杆菌的浓度-时间曲线、时间反应曲线和时间速率曲线与内毒素的相似。金葡萄球菌不能做出浓度时间7曲线、时间反应曲线和时间速率曲线。
12、2.5 临床标本的检测 检测的 19 例临床标本，根据浓度时间曲线、时间反应曲线和时间速率曲线，其中 11 例为真菌感染，有 8 例为细菌曲线，由于所有标本真菌培养阳性，为真菌和细菌混合感染。3 讨论真菌性角膜炎是严重的致盲眼病，主要以镰刀菌、曲霉菌、假丝酵母菌等感染为主1，2 ，近年发病率不断增多，发现戴软镜者3和激光手术后患者也有发病 4 ，此病由于难以确诊（真菌培养需 10 天）延误治疗，以至引起失明，甚至丧失眼球。人们寻找快速诊断真菌感染的方法，鲎血提取液中的 G-因子，可被真菌细胞壁特有成分(13) beta-D-glucan（葡聚糖）激活后经过显色或凝集反应进行检测，可做真菌的定性
13、和定量试验，称为 G 因子法。动态浊度法已在 2005 版药典中用于对内毒素的测定5 ，它是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，我们用此方法分别测定内毒素标准品、葡聚糖标准品、真菌标准株及细菌标准株，并测定 19 例临床标本。临床标本是经培养确诊为真菌感染，根据我们实验的浓度时间曲线、时间反应曲线和时8间速率曲线的形态，11 例为真菌，8 例为细菌的图形，可能为真菌和细菌的混合感染。8 例不能确诊是由于鲎试剂中有 G、B 和 C 因子，B、C 因子用于测定细菌，G 因子用于测定真菌，细菌测定比真菌敏感，当两者混合时，只能测定出细菌。多粘菌素已用于抑制内毒素的凝集反应6
14、 ，我们用多粘菌素来抑制 BC 因子的活性，由于多粘菌素纯度不高，混有内毒素，结果不理想。革兰阳性菌不影响检测，革兰阴性菌影响检测。真菌的细胞壁较为坚固，我们对真菌标准品和临床标本处理时，采用超声的方法，以破坏真菌的结构。有学者从真菌中提取出葡聚糖7 。G 因子法已用于测定间质性浆细胞肺炎血中的葡聚糖8 ，它可检测小鼠念珠菌病9和检测临床病人深层真菌感染 10 。文献报道，1ng1g 葡聚糖与 G 因子可产生凝集反应11 ，与我们的结果相似。我们的实验显示产生反应的葡聚糖的浓度较高，为 200ng100g，可能与鲎试剂的敏感性不同有关。真菌或含有真菌的标本以 10 倍稀释，至少有 34 个浓度
15、凝集反应显著，而细菌在 8 个稀释度中都有反应，另外真菌和革兰阴性细菌的时间反应曲线和时间速率曲线不同，用此方法可检测标本的真菌感染。我们将进一步分离 G 和 B、C 因子，进行特异性反应，可排除细菌9对真菌检测的影响。【参考文献】1 Thomas. Current perspectives on ophthalmic mycoses. Clin Microbiol Rev， 2003， 16：730-797.2 王丽娅.我国真菌性角膜炎的研究现状.眼科，2005，14：143-144.3 Salierno， Goldstein Driebe. Fungal ring infiltrates
16、in disposable contact lens wearers. Clao J， 2001， 27：166-168.4 Karp， Tuli， Yoo， et al. Infectious keratitis after LASIK. phthalmology， 2003， 110：503-510.5 国家药典委员会.中华人民共和国药典，二部，附录 XIE，细菌内毒素检查法，2005 版，附录 87.6 Tsuchiya， Oishi， Takaoka， et al. Discrimination between endotoxin and (13)-beta-D-glucan using turbidimetric kinetic assay with Limulus amebocyte lysate. Chem Pharm Bull (Tokyo)， 1990，38： 25
