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1、第十二章 环境监测中的微生物学方法第一节 水质的细菌学检测 细菌总数 细菌总数是指将l mL水样（原水样或经稀释的水样）放在营养琼脂培养基上，于37培养24小时后，所生长的细菌菌落总数。细菌总数的测定结果常用“cfu（菌落形成单位）/mL”或“个/mL”表示。根据水样中的细菌总数，可将天然水体划分为几类：细菌总数101102 cfu/mL，极清洁水；102103 cfu/mL，清洁水；103104 cfu/mL，不太清洁水；细菌总数104105 cfu/mL，不清洁水；大于105 cfu/mL，极不清洁水。我国生活饮用水的国家标准（GB5749-1985）规定，生活饮用水中的细菌总数不得超过1
2、02 cfu/mL。 腐生细菌数 自然水体中的腐生细菌数与有机物浓度成正比。因此，测得腐生细菌数或腐生细菌数与细菌总数的比值，即可推断水体的有机污染状况。污水带的划分及其特征 污水带、特征 多污带 甲型中污带 乙型中污带 寡污带 腐生细菌数(个/mL) 数十万至数百万 数十万 数万 数十至数万 有机物 含大量有机物，主要是蛋白质和碳水化合物 主要是氨和氨基酸有物含量少 有机物含量极微 溶解氧 极低或几乎没有厌氧性 少量，半厌氧性 较多，需氧性 很多，需氧性 BOD5 非常高 较高 较低 很低 细菌数与腐生带的划分 样点号 细菌总数（百万个/mL） 腐生细菌数（千个/mL） 腐生菌数总菌数（）
3、腐生水 波动范围 平均 波动范围 平均 1 1.73.3 2.5 0.21.9 1.1 0.04 -腐生带 2 1.63.4 2.4 0.93.0 2.0 0.08 -腐生带 3 1.93.0 2.5 0.26.0 2.9 0.11 -腐生带 4 4.35.0 4.6 9.716.5 13.3 0.30 -腐生带 5 1.83.6 2.6 1.46.2 3.0 0.11 -腐生带 6 3.56.8 4.8 59.2175.2 116.0 2.42 多-腐生带 7 3.14.4 3.7 19.220.5 20.0 0.54 -腐生带 8 2.02.7 2.3 10.336.2 20.2 0.84
4、 -腐生带 9 2.36.9 4.0 10.8147.6 64.9 1.62 多-腐生带 粪便污染指示菌 指示菌的理想条件 o 该菌大量存在于人粪中，数量高于病原菌； o 在受人粪污染的水体中该菌易于检出，而未受人粪污染的水体中则无此菌； o 在水体中该菌不会自行繁殖； o 在水体中该菌的存活时间应长于致病菌，对氯与臭氧等消毒剂以及其它不良因素的抵抗力强于致病菌； o 该菌检测方法简捷； o 该菌适用于淡水、海水等各种水体。 较适宜的指示菌大肠菌群（coliform group，简称coliform）、粪链球菌（Streptococcus faecalis）、产气荚膜梭菌（Clostridiu
5、m perfringens）常用作粪污指标菌。 大肠菌群 o 大肠菌群的特征 大肠菌群：指一群需氧、兼性厌氧的，能在37C培养24小时使乳糖发酵产酸产气的G无芽孢杆菌。包括大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等。大肠菌群的鉴别菌 名吲哚试验甲基红试验V.P.试验 柠檬酸钠利用试验 氧化酶试验运动性大肠埃希氏菌 + + - - - 弗氏柠檬酸杆菌- + - + - + 产气肠杆菌- - + + - + 克雷伯氏菌属 - + + - - o 大肠菌群的检测 发酵法 亦称多管发酵法或三管发酵法。以不同稀释度的样品分别接种乳糖胆盐发酵培养基（或其它乳糖发酵培养基）各数管。培养24小时后
6、，观察培养结果。若观察到乳糖发酵产酸产气现象，称为阳性反应。记下阳性反应的试管数，查专用统计表求出大肠菌群的最可能数（MPN）。 滤膜法 选用孔径为0.450.65mm的微孔滤膜，抽滤一定数量的水样，使水样中的细菌截留在滤膜上。然后，将滤膜贴在选择性培养基上，培养后直接计数滤膜上的大肠菌群菌落，算出每100 mL水样中含有的总大肠菌群数。o 大肠菌群指标大肠菌群指数是指每升水中所含的大肠菌群细菌的个数。大肠菌群值则是指检出一个大肠菌群细菌的最少水样量（毫升数）。我国饮用水的质量标准规定，大肠菌群指数不得大于3，大肠菌群值不得小于333mL。第二节 空气的细菌学检测 空气中细菌检测方法 撞击法
7、亦称裂隙式撞击法。利用抽气泵的吸引，使一定量空气强迫通过一狭缝或喷嘴，在出口处形成高速喷射气流，空气中携带微生物的悬浮颗粒依靠惯性撞击并粘附于转动的营养琼脂培养基平皿上，37培养24小时，计算菌落数。计数结果以“cfu/m3”表示。这种采样法不受气流影响，采样量准确，已成为世界各国首选的空气细菌采样方法。 平皿沉降法 靠地心引力将空气中携带微生物的悬浮颗粒沉降到营养琼脂培养基平皿中，37培养24小时，计算菌落数。计数结果以 “cfu/皿（9cm2）”表示。平皿沉降法已有100多年的历史，由于简单易行，曾在国际上广为应用，我国至今仍广泛采用。平皿沉降法的误差较大，已逐渐被淘汰。 空气中细菌总数指
8、标前苏联提出的室内空气的细菌总数指标：清洁空气的细菌总数，冬季4.5103 cfu/m3，夏季1.5103 cfu/m3；污染空气的细菌总数，冬季7103 cfu/m3，夏季2.5103 cfu/m3。日本的细菌总数指标：清洁空气的细菌总数30 cfu皿；普通空气的细菌总数75 cfu/皿。我国室内空气中细菌总数的卫生标准（GB/T170931997）为：细菌总数4103 cfum3（撞击法）或45 cfu皿（沉降法）。 第三节 污染物毒性的细菌学检测 污染物毒性检测（发光细菌检测法） 利用某些细菌的生物发光现象，可借助于活体细胞内具有的ATP、荧光素（FMN）和荧光素酶发光。该发光过程极易受
9、到外界条件的影响，如有毒有害有机物与发光细菌接触时，发光的强度将改变，随着毒物浓度的增加而发光减弱。利用发光细菌检测仪可测得发光细菌的发光强度，从而得知毒物的毒性大小。磷发光杆菌美国贝克曼公司发光细菌检测仪；中科院南土所DXY2型；华东师范大学生物系SDJ1型生物发光光度计 污染物致突变性检测（Ames试验） 鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株（His-），当培养基中不含有组氨酸时它们不能生长，但当受诱变剂作用后，菌体DNA受到损伤，大量细胞回复突变为野生型菌株，这时培养基中即使不含组氨酸，该菌也能生长。利用这个特性可检测被检物质是否具有致突变性。第四节 应用PCR技术检测环境微生物美国Ce
10、tus公司Mullis等人于1985年建立了无细胞分子克隆系统（cell-free molecular cloning）即聚合酶链式反应（polymerase Chain Reaction），简称PCR。该反应是在体外合成特异性DNA片段的方法。 PCR技术的基本原理 反应体系:1、引物2、Taq DNA聚合酶3、反应缓冲液4、模板DNA5、其它成分反应参数:1、变性2、退火3、延伸4、循环次数 o 加热变性，将有待扩增的DNA序列（也即模板），在9495的高温条件下变性，使双链DNA转变为单链DNA。 o 退火，将加热变性后得到的高温变性DNA反应液，缓慢地降温至55。此时引物DNA的碱基与
11、变性后单链模板DNA上一端碱基互补配对。 o 延伸，在72和耐热性Taq DNA多聚酶的作用下，反应体系中游离的四种单核苷酸（dNTP），有序地连接到引物上，并沿模板DNA顺序方向合成新的DNA，进行链的延伸。延伸出的DNA碱基与模板DNA碱基成互补关系。 应用PCR技术检测环境中的致病菌与指示菌 利用PCR技术检测环境中的基因工程菌（GEMs） PCR技术在环境微生物基因克隆中的应用 简述水质细菌总数和腐生细菌数检测的意义。 作为粪便指示菌的理想条件有哪些？ 总大肠菌群与粪大肠菌群有何差异？ 简述大肠菌群的检测方法与大肠菌群指标。 简述发光细菌检测法和Ames试验法的原理。 简述PCR技术的原理与工作条件. 6 / 6
