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1、前列腺癌的免疫组化标记物前列腺癌的免疫组化标记物发表时间：2013-5-13 来源：中外健康文摘2013年第10期供稿 作者：胡新梅 于民 姜敏1 前列腺特异性抗原前列腺特异性抗原前列腺特异性抗原前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)是分子量是分子量34000的的单链糖蛋白，由糖蛋白，由237个氨基酸构成，它是一种个氨基酸构成，它是一种丝氨酸蛋白氨酸蛋白酶，使凝固的精液溶解、液化。它是在使凝固的精液溶解、液化。它是在1979年年作作为前列腺腺上皮前列腺腺上皮细胞的胞的标志物被志物被发现的。的。血清血清PSA目前已被广泛目前已被广泛应用于前列腺癌的早用于前
2、列腺癌的早期期筛查。PSA在正常前列腺、前列腺增生、前列腺癌、前列在正常前列腺、前列腺增生、前列腺癌、前列腺上皮内瘤，均呈阳性表达，定位于上皮腺上皮内瘤，均呈阳性表达，定位于上皮细胞的胞的胞胞质中，而在前列腺中，而在前列腺转移癌移癌则呈阴性表达，因此呈阴性表达，因此PAS阳性提示阳性提示肿瘤来自前列腺上皮，可用于区分前瘤来自前列腺上皮，可用于区分前列腺癌与前列腺列腺癌与前列腺转移癌移癌5。PSA在前列腺良、在前列腺良、恶性病性病变中均呈阳性表达，故中均呈阳性表达，故PSA不能用于不能用于鉴别良良恶性病性病变。几乎所有的前列腺癌（除了分化最差的。几乎所有的前列腺癌（除了分化最差的癌和少数激素治癌
3、和少数激素治疗后复后复发的的进展期癌以外）展期癌以外）PSA标记都阳性，而高分化前列腺癌的都阳性，而高分化前列腺癌的PSA表达表达强于低分于低分化前列腺癌化前列腺癌, 表明表明PSA表达与分化程度有关。而表达与分化程度有关。而对于分化很差的癌，即使于分化很差的癌，即使PSA阴性也不能完全排除前阴性也不能完全排除前列腺癌，列腺癌，还要要结合其他合其他检查综合考合考虑。偶。偶尔PAS阳阳性可出性可出现在前列腺以外的在前列腺以外的组织和和肿瘤，但一般瘤，但一般为局灶性弱阳性局灶性弱阳性 6。5Harvey AM, Grice B, Hamilton C, et a1. Diagnostic util
4、ity of p504s/p63 cocktail, prostate-specific antigen, and prostatic acid phosphatase in Verifying prostatic carcinoma involvement in seminal Vesicles: a study of 57 cases of radical prostatectomy, speciments of pathologic stage pT3bJ. Arch Pathol Lab Med,2010,134(7):983-988.6Bostwick D G, Qian J, Ra
5、mnani D M. Immunohistochemistry of the prostate and bladder, testis and renal tumors. In: Dabbs D J, ed. Diagnostic Immunohistochemistry. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2002.407-33CK34El21984年，年，Gown等等7首先首先报道了道了CK34El2，它是一，它是一种高分子量种高分子量5700066000的的细胞角蛋白。胞角蛋白。CK34El2标记良性前列腺良性前列腺组织，仅在前列腺基底在前列腺基底
6、细胞的胞的细胞膜以及胞膜以及细胞胞质中表达，而不在前列腺中表达，而不在前列腺分泌上皮分泌上皮细胞表达，故胞表达，故CK34El2可作可作为对前列腺前列腺的基底的基底细胞胞层进行行选择性的性的标记8。由于基底。由于基底细胞消失是胞消失是诊断前列腺癌的重要形断前列腺癌的重要形态学依据，而学依据，而苏木素木素-伊伊红染色切片判断基底染色切片判断基底细胞是否存在常十分胞是否存在常十分困困难，因此用，因此用CK34El2标记基底基底细胞就成胞就成为前列前列腺良腺良恶性性鉴别诊断的重要手段之一。断的重要手段之一。在正常和良性增生以及上皮内瘤的前列腺腺体，在正常和良性增生以及上皮内瘤的前列腺腺体，导管周管周
7、围形成形成连续或断或断续的的CK34E12分布。而前分布。而前列腺癌的腺体的基底列腺癌的腺体的基底细胞胞层完全消失，所以最完全消失，所以最终表表现为CK34E12不表达。但不表达。但CK34E12标记基底基底细胞可部分阴性，胞可部分阴性，对经尿道尿道电切的切的标本，常因本，常因标本本经人人为烧灼而受影响，因此可靠性和灼而受影响，因此可靠性和稳定性欠佳。定性欠佳。有有20%30%的前列腺癌的前列腺癌导管腺癌和管腺癌和筛状癌周状癌周围有有连续或或间断的基底断的基底细胞，而部分良性前列腺病胞，而部分良性前列腺病变,如腺病和不完全性萎如腺病和不完全性萎缩的腺泡周的腺泡周围基底基底细胞可部胞可部分甚至完
8、全消失。分甚至完全消失。说明基底明基底细胞消失并非胞消失并非诊断前断前列腺癌的列腺癌的绝对指指标。而免疫。而免疫组化操作不当，化操作不当，则有有可能出可能出现假阴性假阴性结果而果而误诊。故免疫。故免疫组化化结果果应结合合HE切片中的其他形切片中的其他形态学特征学特征综合判断。合判断。P63 1998年，年，Okada等等9分离出新基因分离出新基因P63，P63是是P53抑癌基因家族的成抑癌基因家族的成员，位于人，位于人类染色体染色体3q27-29。P63能特异性地能特异性地标记前列腺基底前列腺基底细胞，呈胞核胞，呈胞核阳性，棕黄色阳性，棕黄色颗粒状，故而可以粒状，故而可以显示基底示基底细胞的胞
9、的存在，而前列腺的分泌上皮存在，而前列腺的分泌上皮细胞胞则呈阴性呈阴性10。绝大多数的前列腺良性增生及低大多数的前列腺良性增生及低级别上皮内瘤的上皮内瘤的腺体的周腺体的周围呈呈现连续性的性的P63分布；而高分布；而高级别上皮上皮内瘤可内瘤可见P63不同程度的不同程度的间断消失，而前列腺癌中断消失，而前列腺癌中腺体周腺体周围P63为阴性，阴性，显示基底示基底细胞已胞已经完全的消完全的消失。因此，失。因此，P63也可用于前列腺癌的也可用于前列腺癌的鉴别诊断。断。CK34E12、P63均可用于均可用于标记基底基底细胞，而胞，而作作为诊断前列腺癌的有力手段。断前列腺癌的有力手段。P63与与CK34El
10、2相比，具有以下相比，具有以下优点：点：部分部分CK34E12标记阴性的基底阴性的基底细胞，胞，P63标记可可呈阳性；呈阳性；对有有烧灼的灼的经尿道尿道电切的前列切的前列腺腺标本，本，P63标记结果比果比较稳定。定。P63标记基底基底细胞呈核阳性，胞呈核阳性，结果容易判断，背果容易判断，背景比景比较清晰。缺点清晰。缺点则是其阳性表达是是其阳性表达是间断断的，当可疑腺泡少的，当可疑腺泡少时，判断其基底，判断其基底细胞是胞是否消失有否消失有时比比较困困难。在。在实际应用中，两用中，两者具有互者具有互补作用。作用。基底基底细胞消失是前列腺癌的重要胞消失是前列腺癌的重要诊断依据，断依据，但局部的基底但
11、局部的基底细胞缺失却不能作胞缺失却不能作为诊断前断前列腺癌的唯一列腺癌的唯一标准。由于前列腺癌可有残准。由于前列腺癌可有残留的基底留的基底细胞，而且浸胞，而且浸润性癌在管腔内性癌在管腔内扩散及良性腺体陷入癌散及良性腺体陷入癌组织中中11,因此个因此个别前列腺癌中前列腺癌中CK34El2与与P63亦有阳性表达。亦有阳性表达。少数前列腺增生病少数前列腺增生病变基底基底细胞胞标记亦呈阴亦呈阴性表达，性表达，说明少数前列腺良性腺体基底明少数前列腺良性腺体基底细胞可以不胞可以不连续或不能被或不能被证实存在，存在，这也提也提示基底示基底细胞免疫胞免疫标志物阴性不能志物阴性不能单独作独作为确确诊恶性的指性的
12、指标。-甲基-辅酶A-消旋酶 (P504s)2001年年Jiang等等12首次将首次将P504s抗体抗体应用于用于前列腺癌的前列腺癌的诊断。断。P504s即即-甲基甲基-辅酶A-消消旋旋酶(alpha-methylacyl-CoA racemase)，其，其基因定位于染色体基因定位于染色体5P13，它所，它所编码的蛋白的蛋白由由382个氨基酸个氨基酸组成，在支成，在支链脂肪酸的脂肪酸的-氧氧化和衍生化和衍生过程中起作用。程中起作用。P504s在前列腺癌在前列腺癌中高表达，而在正常中前列腺中高表达，而在正常中前列腺组织中中则呈呈阴性或灶性弱阳性。阴性或灶性弱阳性。Jiang等在所等在所检测的的1
13、37例前列腺癌中阳性率高达例前列腺癌中阳性率高达100%，并提出，并提出P504s是前列腺癌高度敏感性和特异性的是前列腺癌高度敏感性和特异性的标记物。物。P504s阳性，阳性，CK34El2和和p63阴性，能从正反两面阴性，能从正反两面支持前列腺癌支持前列腺癌诊断，从而大大提高前列腺癌的断，从而大大提高前列腺癌的诊断正确率断正确率13。然而，。然而，临床上并非所有的前列腺床上并非所有的前列腺癌都是癌都是P504s阳性，阳性，CK34El2及及p63阴性，也并非阴性，也并非所有的前列腺良性病所有的前列腺良性病变都是都是P504s阴性，阴性，CK34El2及及p63完整阳性。完整阳性。杨京哲京哲1
14、4等人的等人的试验中，中，P504s不不仅在前列腺癌中有高表达，而且在前列腺在前列腺癌中有高表达，而且在前列腺上皮内瘤中也高表达，上皮内瘤中也高表达，这表明表明P504s不但不但对前列腺前列腺癌敏感，并且癌敏感，并且对PIN也非常敏感，故用也非常敏感，故用P504s只能只能区区别前列腺良性增生，而不能把前列腺癌和前列腺良性增生，而不能把前列腺癌和PIN鉴别开来。开来。2004版版 WHO中，中， P504s在前列腺癌的阳性在前列腺癌的阳性率率为80%以上，但在某些前列腺癌如泡沫状以上，但在某些前列腺癌如泡沫状腺癌、萎腺癌、萎缩性癌、假增生性癌和治性癌、假增生性癌和治疗后前后前列腺癌中阳性率比列
15、腺癌中阳性率比较低。而且低。而且P504s在在12%的良性增生，的良性增生，17.5%的前列腺腺病，萎的前列腺腺病，萎缩型型腺体以及腺体以及90%以上的高以上的高级别PIN中呈阳性反中呈阳性反应。此外，。此外，P504s在前列腺以外的在前列腺以外的肿瘤如尿瘤如尿路上皮癌、路上皮癌、结肠癌、癌、肾癌以及良性癌以及良性肾源性源性腺瘤也可阳性。腺瘤也可阳性。这表明表明P504s没有没有组织特异特异性，不是前列腺癌的特异性性，不是前列腺癌的特异性标志物。志物。综上所述，免疫上所述，免疫组化在前列腺癌化在前列腺癌诊断中的断中的应用具有重要价用具有重要价值，但决不能完全依靠免，但决不能完全依靠免疫疫组化去
16、化去诊断前列腺癌，断前列腺癌，单独的独的P504s(或基或基底底细胞胞标志物志物)阳性或阴性均不能确阳性或阴性均不能确诊前列前列腺癌。只有将腺癌。只有将组织病理形病理形态与免疫与免疫组化染化染色色结果果结合起来，全面分析，合起来，全面分析，综合判断，合判断，才能有效地避免才能有效地避免误诊。免疫酶细胞化学实验技术-实用免疫细胞与核酸技术（周德山）免疫免疫酶细胞化学是免疫胞化学是免疫细胞化学胞化学（Immunocytochemistry,ICC）中最常用的方）中最常用的方法之一，它是在抗原抗体特异反法之一，它是在抗原抗体特异反应存在的存在的前提条件下，借助于前提条件下，借助于酶细胞化学的手段，胞
17、化学的手段，检测某种物某种物质（抗原（抗原/抗体）在抗体）在组织细胞内胞内存在部位的一存在部位的一门新技新技术：即：即预先将抗体与先将抗体与酶连结，再使其与，再使其与组织内特异抗原反内特异抗原反应，经细胞化学染色后，于光胞化学染色后，于光镜或或电子子显微微镜下下观察分析的形察分析的形态学研究方法。学研究方法。为克服克服荧光抗体法的不足、并能在超微光抗体法的不足、并能在超微结构水平定位抗原物构水平定位抗原物质的存在部位，的存在部位，Nakane(1966)等成功地引入了等成功地引入了酶代替代替荧光色光色素素标记抗体，抗体，进行行组织细胞内抗原或半抗胞内抗原或半抗原的定位，开辟了原的定位，开辟了酶
18、标抗体技抗体技术免疫免疫酶细胞化学之路。胞化学之路。结合笔者合笔者经验，介，介绍ICC染色中的主要程序：染色中的主要程序：组织标本的固定、切片、染色原理及步本的固定、切片、染色原理及步骤、结果判定及一些果判定及一些进展、特殊展、特殊应用等供用等供读者者参考。参考。第一节固定和切片一、固定一、固定若想得到理想的若想得到理想的ICC染色染色结果、正确地判断抗原物果、正确地判断抗原物质在在组织细胞内的位置，除需有良好胞内的位置，除需有良好酶和抗体外，和抗体外，保持保持组织细胞内抗原物胞内抗原物质的不的不动性（性（Immobility）和免疫活性也是至关重要的。和免疫活性也是至关重要的。换言之，如果抗
19、原言之，如果抗原物物质在在组织细胞胞间弥散、弥散、丢失或失去免疫活性，失或失去免疫活性，无无论如何努力染色都是徒如何努力染色都是徒劳的，所以的，所以说固定是固定是ICC染色中非常重要的一染色中非常重要的一环。ICC与其它与其它组织学技学技术不不同，除要求保存良好的同，除要求保存良好的结构外，构外，还需保存需保存组织抗抗原的免疫活性。一般原的免疫活性。一般认为，新，新鲜组织能能够最大限最大限度地保存度地保存组织抗原的免疫活性，但抗原的免疫活性，但结构构较差，易差，易出出现抗原弥散抗原弥散丢失失现象。象。Cumming（1980）报告，不固定的告，不固定的组织切片切片ICC染染色色时，环鸟苷酸含量
20、苷酸含量丢失失80%以上。固定的目的以上。固定的目的是使构成是使构成组织细胞成分的蛋白等物胞成分的蛋白等物质不溶于水和不溶于水和有机溶有机溶剂，并迅速使，并迅速使组织细胞中各种胞中各种酶降解、失降解、失活，防止活，防止组织自溶和抗原弥散，保持自溶和抗原弥散，保持组织细胞的胞的完整性和所要完整性和所要检测物物质的抗原性。因此迅速充分的抗原性。因此迅速充分固定是固定是ICC染色成功的关染色成功的关键一步。用于一步。用于ICC的固定的固定剂种种类较多，多，选择时应根据所要根据所要检测物物质的抗原性的抗原性质和切片方法以及所用抗体特征等做最佳和切片方法以及所用抗体特征等做最佳筛选。制片及固定方法制片及
21、固定方法见第一章，下面介第一章，下面介绍两种近年两种近年报道的新方法。道的新方法。1AMEX（Acetone Meth Enzoate Xylene ）法）法是改良的冰是改良的冰冻置置换法（法（freeze substitution）的）的简称，主要用于石蜡包埋称，主要用于石蜡包埋标本。本。Sato(1986)报告，告，该法具有同新法具有同新鲜（未固定）（未固定）组织冰冰冻切片同切片同样的抗的抗原保持性和石蜡切片的良好原保持性和石蜡切片的良好组织结构保存。其机构保存。其机制制为：组织在丙在丙酮中固定（脱水），中固定（脱水），组织细胞内胞内水份逐水份逐渐被丙被丙酮取代，取代，继之，用苯甲酸之，用
22、苯甲酸酯取代取代组织内丙内丙酮，经二甲苯置二甲苯置换后，石蜡包埋。后，石蜡包埋。组织在在-20丙丙酮内内过夜亦形成冰晶，所以原方法将夜亦形成冰晶，所以原方法将组织先置先置4丙丙酮2030min，再移入，再移入-20丙丙酮过夜。夜。实际上上组织在在4丙丙酮内内过夜亦可得到同夜亦可得到同样效果。效果。如在如在该固定液内加入少量蛋白固定液内加入少量蛋白酶活性阻断活性阻断剂，并，并采用低溶点石蜡包埋等，可采用低溶点石蜡包埋等，可获得更佳染色得更佳染色结果。果。微波固定（Microwave fixation）为近几年所注目的近几年所注目的问题之一。之一。该方法能保持良好方法能保持良好的的组织结构和抗原性
23、，适于各种切片的构和抗原性，适于各种切片的酶组化、化、ICC以及免疫以及免疫电镜等材料固定。其固定机理可能与等材料固定。其固定机理可能与微波（微波（频率率10003000MHz）具有被水分吸收的）具有被水分吸收的性性质（通常所用的微波是（通常所用的微波是频率率2450MHz，波，波长12cm）；生物材料含有大量水份，照射后，温度）；生物材料含有大量水份，照射后，温度升高，分子运升高，分子运动加快，促加快，促进固定液向固定液向组织内渗透，内渗透，加速与加速与组织成分的反成分的反应，短，短时间内达到固定的效内达到固定的效果等有关。果等有关。经微波照射固定的微波照射固定的组织，需置相同固，需置相同固
24、定液中，定液中，继续固定固定26h，室温。，室温。二、切片光光镜ICC染色，常用的有冰染色，常用的有冰冻切片和石蜡切切片和石蜡切片两种，二者各有其片两种，二者各有其优缺点，缺点，应根据抗原根据抗原的性的性质、实验室条件，合理室条件，合理选择之。之。对未未知抗原知抗原显示示时，最好同，最好同时应用。冰用。冰冻切片切片为ICC研究所首研究所首选。Shi（1991）等）等报告：微波炉照射的切片，告：微波炉照射的切片，能能够激活部分核内抗原活性。其机制不清，激活部分核内抗原活性。其机制不清，可能与高温、高可能与高温、高热的作用，使核内的作用，使核内DNA双双链解开，解开，DNA、RNA解离，抗原暴露有
25、关。其解离，抗原暴露有关。其步步骤为：将切片脱蜡水洗后，置染色瓶中，：将切片脱蜡水洗后，置染色瓶中，加入去离子水或加入去离子水或缓冲液至瓶冲液至瓶颈处，反复多，反复多次照射，每次次照射，每次1min，照射，照射510次，每次照次，每次照射后，射后，补充瓶中蒸充瓶中蒸发掉的液体，照射温度掉的液体，照射温度不超不超过9095为宜。此宜。此处理后，理后，细胞核胞核染色以染色以苏木精木精为佳佳第二节染色方法一、本科一、本科标抗体法抗体法酶标抗体技抗体技术是通是通过共价共价键将将酶连结在抗在抗体上，制成体上，制成酶标抗体，再借抗体，再借酶对底物的特底物的特异催化作用，生成有色的不溶性异催化作用，生成有色
26、的不溶性产物或具物或具有一定有一定电子密度的子密度的颗粒，于光粒，于光镜或或电镜下下进行行细胞表面及胞表面及细胞内各种抗原成分的定胞内各种抗原成分的定位。位。（一）（一）酶的种的种类及特点及特点从理从理论上上讲，用，用细胞化学方法能胞化学方法能显示的示的酶，均可用于均可用于标记抗体，抗体，进行行ICC染色，但染色，但实际上在上在ICC中所能用的中所能用的酶并不多。并不多。现将常用的将常用的几种几种酶列于表列于表4-1，供，供选用用时参考。参考。Sternberger(1986)指出，用于指出，用于标记的的酶应具具备以下以下几点几点酶催化的底物必催化的底物必须是特异的，且容易被是特异的，且容易被
27、显示，所形成的示，所形成的产物易于光物易于光镜或或电镜下下观察；察；所所形成的形成的终产物沉淀必物沉淀必须稳定，即定，即终产物不能从物不能从酶活性部位向周活性部位向周围组织弥散，影响弥散，影响组织学定位；学定位；较易易获得的得的酶分子，最好有商品出售；分子，最好有商品出售；中性中性pH时，酶应稳定，定，酶标记抗体后，保存抗体后，保存12年活性年活性不不应改改变，且，且酶的催化活性（的催化活性（Turnover）越高越）越高越好；好；酶标过程中，程中，酶与抗体与抗体连结，不能影响二，不能影响二者的活性；者的活性；被被检测组织中，不中，不应存在与存在与标记酶相同的内源性相同的内源性酶或或类似物似物
28、质。（二）本科标抗体的制备（Boosma,DM, 1983）酶标抗体与抗体与荧光色素光色素标记抗体不同，它需抗体不同，它需借助借助桥-偶偶联剂的作用，将的作用，将酶连结在抗体分在抗体分子上。偶子上。偶联剂是一种双功能是一种双功能试剂，具，具备3个个基本特征：基本特征：偶偶联剂与抗体和与抗体和酶之之间的的连结，必，必须是不可逆的，即借共价是不可逆的，即借共价键连结；偶偶联剂不不应影响影响酶和抗体的活性；和抗体的活性；不不能因偶能因偶联剂的加入，使的加入，使酶与与组织成分了生成分了生非特异非特异结合。合。抗体制作步抗体制作步骤未列出未列出（四）染色原理及步骤1基本原理基本原理酶标抗体与抗体与荧光色
29、素光色素标记抗体的染色相抗体的染色相同，亦分直接法和同，亦分直接法和间接法。直接法是将接法。直接法是将酶直接直接标记在每一在每一抗体上，抗体上，间接法是将接法是将酶标记在第二抗体上，在第二抗体上，检测组织细胞胞内的特定抗原物内的特定抗原物质。间接法所用的第一抗体是接法所用的第一抗体是对组织细胞胞内某种抗原的特异性抗体（内某种抗原的特异性抗体（80%90%的抗血清系由家兔的抗血清系由家兔制得，而制得，而绝大数大数单克隆抗体系由小鼠制克隆抗体系由小鼠制备）；第二抗体）；第二抗体则为第一抗体（家兔第一抗体（家兔/小鼠的小鼠的IgG）的抗体。所以，只要不同）的抗体。所以，只要不同的第一抗体均来自同一种
30、属，同一的第一抗体均来自同一种属，同一标记的第二抗体就能用的第二抗体就能用来来显示其不同特异性抗原的存在，示其不同特异性抗原的存在，这样可避免了直接法中可避免了直接法中标记每一种第一抗体的麻每一种第一抗体的麻烦，并且提高了方法的敏感度。，并且提高了方法的敏感度。目前的目前的ICC染色中，以染色中，以间接法接法为常用，在此着重介常用，在此着重介绍间接接法的染色程序。法的染色程序。2染色程序（1）切片准）切片准备：见第一章。第一章。石蜡切片石蜡切片经二甲苯或二甲苯或Hemo-De脱蜡，下行脱蜡，下行酒精至水。酒精至水。固定固定/无固定新无固定新鲜组织冰冰冻切片，室切片，室温干燥温干燥2h以上。以上
31、。（2）未固定的新）未固定的新鲜组织切片，丙切片，丙酮固定固定2030min(fretrieval )，简而言之，即用蛋白而言之，即用蛋白酶处理，理，去除固定去除固定剂交交联造成的空造成的空间遮蔽（室温），遮蔽（室温），风干干1530min.;已固定的已固定的组织冰冰冻切片及石蜡切片，切片及石蜡切片，根据需要可根据需要可进行行组织抗原的激活。抗原的激活。（3）用蜡笔沿切片周）用蜡笔沿切片周围勾划一道屏障，以避免孵勾划一道屏障，以避免孵育液流失及孵育育液流失及孵育过程中切片干燥，同程中切片干燥，同时也能也能节省抗体用量，保持切片与抗体的充分接触，省抗体用量，保持切片与抗体的充分接触，风干。干。石
32、蜡切片（滴少量石蜡切片（滴少量PBS，以防其干燥）直接，以防其干燥）直接进行步行步骤（6）。）。（4）切片）切片经PBS或其它或其它缓冲液漂洗冲液漂洗3次，每次次，每次2min，溶解除去冰，溶解除去冰冻切片上的切片上的OCT包埋包埋剂。但。但应用用ALP标记抗体抗体时，禁用二甲，禁用二甲胂酸酸钠缓冲液漂洗，冲液漂洗，因后者可使因后者可使ALP失活。失活。（5）根据需要，用甲醇）根据需要，用甲醇+0.3%H2O2处理切片理切片1530min（室温），封（室温），封闭内源性内源性过氧化氧化酶的活性。的活性。应用用ALP标记抗体抗体时，此步可省略。，此步可省略。（6）PBS漂漂 洗洗2min（共两次
33、），移至（共两次），移至0.05%Tween-20/PBS(或或0.221%Triton X-100)中中5min（室温）。（室温）。Tween-20为一种表面活性一种表面活性剂，除，除具有清具有清洁作用外，作用外，还可增加可增加组织的通透性，有利的通透性，有利于于组织细胞内抗原的胞内抗原的显示。示。（7）4%Block Ace或或0.1%1%BSA湿盒内孵育湿盒内孵育1525min（室温），然后；（室温），然后；轻轻弃去孵育液（不冲洗）弃去孵育液（不冲洗）；以阻断；以阻断组织与抗体的非特异性与抗体的非特异性结合，降低背景合，降低背景染色。染色。（8）根据需要，可用）根据需要，可用1/51/3
34、0正常来活兔正常来活兔/羊血羊血清孵育清孵育1520min（室温，以（室温，以酶标抗体相同种属正抗体相同种属正常血清常血清为宜，最好是同一宜，最好是同一动物免疫前的血清）。物免疫前的血清）。或者省略此步，而在稀或者省略此步，而在稀释酶标抗体抗体时，加入，加入1%2%的同一种属正常血清。的同一种属正常血清。9）轻轻弃去孵育液，弃去孵育液， 滴加含滴加含0.2%BSA/0.05 NaN3/PBS稀稀释的第一抗体（抗体用量：每的第一抗体（抗体用量：每张切片切片一般一般为5080l），湿盒内孵育），湿盒内孵育12h（2025）；免疫）；免疫电镜用用标本，本，4过夜。夜。（10）PBS充分冲洗（充分冲洗
35、（3次次2min），以去除切片），以去除切片上非特异吸附的抗体。上非特异吸附的抗体。应用不同的第一抗体或同用不同的第一抗体或同时进行行对照照标本染色本染色时，需分，需分别冲洗，以防相互冲洗，以防相互污染。染。（11）经0.05%Tween-20/PBs 2min后后,滴加含滴加含0.2%BSA/1%正常血清正常血清/PBS稀稀释的的HRP酶标记的第的第二抗体二抗体,湿盒内孵育湿盒内孵育4560min(2025)。（12）PBS漂洗（漂洗（3次次2min）,此此处不需分不需分别漂洗，漂洗，因所有切片均系同一因所有切片均系同一酶标抗体孵育。抗体孵育。（13）未固定或固定）未固定或固定较弱的冰弱的冰
36、冻切片，此切片，此处可可轻微固定。首先将切片从微固定。首先将切片从PBS移至移至TBS中中35min，去除去除PBS，以防其中的磷酸与后面使用的固定液中，以防其中的磷酸与后面使用的固定液中的的CaCl2形成磷酸形成磷酸钙而沉淀后，然后用而沉淀后，然后用Baker氏固氏固定液固定定液固定5min（室温）此（室温）此时轻微固定，既不影响微固定，既不影响抗原抗体抗原抗体结合，又合，又较有利于保存第一抗体孵育前有利于保存第一抗体孵育前的的组织抗原，尤其适用于抗原，尤其适用于单克隆抗体的克隆抗体的ICC染色。染色。（14）呈色：）呈色：HRP标记抗体的呈色液抗体的呈色液为0.01%0.1%H2O2 0.
37、01%0.05% DAB 0.050.1mol/L Tris HCl(pH7.4)。切片。切片经PBS或或Tris-HCl液漂洗后，置液漂洗后，置上述呈色液内上述呈色液内1015min（室温、暗（室温、暗处），亦可），亦可镜下控制下控制显色速度。色速度。终产物物为棕褐色沉淀。用于棕褐色沉淀。用于电镜观察的察的标本，呈色本，呈色35min即可，防止即可，防止DAB终产物向周物向周围扩散，影响超微散，影响超微结构定位。另外，构定位。另外，显色色液液应于用前新于用前新鲜配制，避免配制，避免DAB本身氧化本身氧化变质。新配制的新配制的DAB为无色透明液体。若无色透明液体。若DAB液已氧化液已氧化变为紫
38、紫红色，色，应换新新药重新配制。重新配制。（15）将切片置流水中（）将切片置流水中（仅光光镜观察）或察）或PBS（电镜标本）内，本）内，终止呈色反止呈色反应。（16）未固定的冰）未固定的冰冻切片，可用切片，可用1%戊二戊二醛-PBS液液加加强固定固定510min（室温），流水冲洗。（室温），流水冲洗。17）细胞核胞核轻度染色，以甲基度染色，以甲基绿和和苏木精木精为常用。常用。前者前者细胞核呈胞核呈绿色，与色，与HRP/ALP等等终产物物对比度尤比度尤佳，但不适于微波照射的佳，但不适于微波照射的标本。本。苏木精是木精是组织学、学、病理学研究中普遍病理学研究中普遍应用的核染色方法，与用的核染色方法
39、，与HRP、ALP的的终产物物对比度比比度比较好。好。（18）DAB呈色的呈色的标本，可以系列酒精脱水、本，可以系列酒精脱水、Hemo-De透明、透明、DPX封固。其它物封固。其它物质呈色的呈色的标本，本，在有机溶在有机溶剂中沉淀物易溶解，褪色，所以用水溶中沉淀物易溶解，褪色，所以用水溶性封固性封固剂如明胶甘油等封固，次日，于盖玻片周如明胶甘油等封固，次日，于盖玻片周围涂少涂少许女士用指甲油，可使切片保存女士用指甲油，可使切片保存时间更更长。（19）镜检、观察察记录同一般形同一般形态学研究。学研究。（20）免疫）免疫电镜用用标本，本，经OSO4后固定，按后固定，按电镜标本要求本要求处理（参理（
40、参见本本书第七章）。亦可第七章）。亦可OSO4固定，固定，喷碳（碳（Carbon Coating）,利用利用扫描描电镜观察察抗原的存在部位。抗原的存在部位。免疫组化的试剂准备最重要的是最重要的是选择好一抗、二抗或者好一抗、二抗或者还有三抗，注有三抗，注意抗体的特异性、效价和交叉反意抗体的特异性、效价和交叉反应，最好用，最好用单抗。抗。其他常用其他常用试剂有：有：1、0.01M(pH7.4)的磷酸的磷酸盐缓冲生理冲生理盐水（水（PBS），），稀稀释抗体和洗片子用；抗体和洗片子用；2、清、清洁液、液、纯水，洗玻片用水，洗玻片用3、多聚、多聚赖氨酸氨酸处理理载玻片，防止脱片玻片，防止脱片4、固定液：
41、、固定液：4%多聚甲多聚甲醛或冷丙或冷丙酮等；等；5、15%30%蔗糖，蔗糖，组织脱水用；脱水用；6、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，或者或者OCT包埋做冰包埋做冰冻切片；切片；7、抗原修复液：枸、抗原修复液：枸橼酸酸缓冲液（冲液（pH6.0）；）；8、活化、活化剂：EDTA或者或者Triton X-100；9、1%10%牛血清清蛋白（牛血清清蛋白（BSA）封）封闭液；液；10、H2O2，灭活内源性活内源性过氧化物氧化物酶；11、显色液：根据你做的色液：根据你做的酶来来选择，如果，如果是是HRP就用就用DAB，如果是，如果是AKP，就用，就用NBT/BCIP，免疫，免疫荧光光则不需要；不需要；12、50%缓冲甘油封片液。冲甘油封片液。免疫细胞化学常用试剂介绍
