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1、1从血液中提取 DNA 方法探讨摘 要 目的：研究从血液中提取 DNA 的方法以应用。方法：静脉抽取血样，分别抗凝或不加抗凝处理后，提取 DNA，通过电泳和 PCR 进行检测。结果：凝血和抗凝血的 DNA 产量和纯度分别是(40.2 8.86) mg DNA/L 血液和(1.87 0.11) mg DNA/L，(39.1 10.2) mg DNA/L 血液和(1.92 0.12) mg DNA/L。所有样本的DNA 分子量都很高，从两者的 DNA 样本中能很容易地扩增出tPA 基因的第 8 内含子区 Alu 等位基因二态性，因此所提取的DNA 是完整可靠的。结论：该方法能快速、简单、有效、无毒
2、地从新鲜血液和凝血中提取 DNA，适合于临床检测和分子生物学研究。关键词 DNA 提取;血液;DNA 检测DNA Isolation by Simple Rapid and Innocuous Method from Blood Useful in Clinical Molecular TestingAbstract: Objective To study the method of DNA 2isolation from blood for application. Methods DNA was isolated and determinated by agarose gel electr
3、ophoesis and PCR from antiagglutinating and agglutinating blood samples that were withdrawn from auricular veins. Results The yields and purity of DNA isolated from clotted blood and antiagglutinating blood were (40.2 8.86) mg DNA/L blood and (1.87 0.11)，(39.1 10.2) mg DNA/L blood and (1.92 0.12). T
4、he DNA that we isolated from all samples has high molecular weight and by PCR the dimorphism of Alu alleles of the 8th intron of tPA was easy to be obtained, so it was complete and reliable. Conclusion The results showed this method is rapid, easy, efficient and innocuous for isolation of DNA from c
5、lotted and fresh blood and it is suit for clinical testing and molecular biology study.Key words: DNA isolation;Blood;DNA determination常规的临床检测实验室中往往要收集大量的未凝结血液，而将凝血丢掉。分子生物学实验中，常用来自 EDTA 抗凝或枸椽酸钠抗凝的外周血来做 DNA 来源1，2 , 由于抗凝剂的加入,往往使3血浆不能用于检测其他项目。分离完白血球后，多数程序要用酶法消化细胞，然后是用对人体有害的有机溶剂(如酚 氯仿) 抽提及用乙醇沉淀3 。为了减少实验
6、检测血液的用量，已有些报道从凝血中提取 DNA 35 ，然而这些技术有些比较不实用，易造成污染，或者比较耗时，要用到酶、RNA 去除步骤；有些要求样本体积大，所需试剂在常规的实验室中不具备使用条件等。我们经多次实验并参考其他资料，优化出一种不需要酶而且不使用有机溶剂抽提的程序，能有效地从新鲜血液和凝血中提取 DNA，适用于临床检测及分子生物学实验。1 材料和方法1.1 样本来源 静脉抽取 30 份健康体检者血样。10 份用EDTA 抗凝, 10 份不加抗凝处理， 10 份不抗凝在-40 冻存 2 a 左右。1.2 DNA 提取方法 取凝血块，用 9 g/L 氯化钠匀浆大约 30 s，每换一个样
7、本都要用 70%乙醇和 9 g/L 氯化钠清洗匀浆器以避免交叉污染。取匀浆后样本 1 ml 置于离心管中，室温 8 000 r 离心45 min 后，去掉上层。血细胞在 1 ml 的 Tris 缓冲液 I(10 mmol/L TrisHCl， pH 8.0；10 mmol/L 氯化钾；10 mmol/L 氯化镁；2 mmol/L EDTA，pH 8.0；25 mL/L Triton X100)中裂解 10 min, 其间轻轻用力充分混匀, 室温 10 000 r 离心 2 min，沉淀要用 Tris 缓冲液 I 洗 2 次。将沉淀用 220 l 的 Tris 缓冲液 II (10 mmol/L
8、 TrisHCl， pH 8.0；10 mmol/L 氯化钾；10 mmol/L 氯化镁；2 mmol/L EDTA，pH 8.0；0.4 mol/L 氯化钠；10 g/L SDS)悬浮，轻轻振荡试管, 使底部细胞团块散开，在 56 保温 15 min 裂解。加入 100 l 5 M 氯化钠充分振荡沉淀去除蛋白质。10 000 r 离心5 min，取上清。加 2.5 倍体积的无水乙醇沉淀 DNA 后，10 000 r离心 5 min，弃上清。室温晾 20 min 左右待酒精挥发干净后以适量 TE 缓冲液(10 mmol/L TrisHCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA)回溶。EDT
9、A 抗凝血中 DNA 的提取从去掉上层开始。1. 3 DNA 浓度检测 用分光光度计在 260 nm 测 DNA 浓度。1. 4 DNA 纯度检测 DNA 的纯度用 A260/A280 比值表示3 。结果以均值SD 表示。51. 5 DNA 分子量检测 DNA 样本的完整性用 0.7%琼脂糖凝胶电泳证实，溴化乙锭染色，紫外灯观察。1. 6 PCR 检测 PCR 扩增组织型纤溶酶原激活因子(tPA) 第8 内含子 Alu 等位基因插入(I) 和缺失(D) 二态性6来评价 DNA的可靠性。PCR 引物序列如下：Alu1 5GTA AGA GTT CCG TAA CAG GAC AGC T3, Al
10、u2 5CCC CAC CCT AGG AGA ACT TCT CTT T3 。反应体系组成为：10PCR buffer 5 l , 25 mM 氯化镁 6 l , 10 mM each dNTPs 1 l , 10 M primer 上下游各 1 l , DNA 2 l ，Taq 酶 1 l 。PCR 反应程序为：95 5 min 预变性，然后 94 1 min ,58 1 min,72 2 min 循环 40次，在 72 充分延伸 10 min。1. 7 结果 以均值SD 表示。2 结果6凝血和抗凝血的 DNA 产量和纯度(A260/A280)相似。这些数据和用蛋白酶 K 处理及有机溶剂提
11、取的相似7 ，比其他盐析程序报道的要高1，5，7 ，见表 1。表 1 从冻存的和新鲜的凝血以及 EDTA 抗凝血中提取的DNA 的浓度和 A260/A280 比值（略）凝胶电泳显示所有样本的 DNA 分子量都很高(图 1)，而且从两者的 DNA 样本中能很容易地扩增出 tPA 基因的第 8 内含子区Alu 等位基因二态性( 图 2)。这些表明，此方法能有效地从血液中提取出基因组 DNA。图 1 抗凝血、凝血和冻存凝血 DNA 提取比较。抗凝血DNA(1-2)、凝血 DNA(3-5)和冻存凝血(6-8)DNA 琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外分析。MDNA Marker(EcoT14 I dige
12、st, 购自 TaKaRa)。 （略）图 2 PCR 扩增 tPA 8th 内含子 Alu 等位基因插入/ 缺失(I/D)二态性结果。lane1、3 、6 为 I/I；lane2 为 D/D；lane4 、57为 I/D。 （略）3 讨论应用此方法进行提取，整个过程基本可在常温完成，处理多个样本的时间要比其他方案短2，3 ，7, 而且不需要酶和有机溶剂，DNA 产量、纯度、分子量和可靠性都较高，这些特征使得该程序更加适合于临床检测和常规实验室操作。从冷冻保存的凝血中提取的 DNA 较少( 见表 1)，可能是从冻存标本中去除血红素需要的清洗步骤较多的缘故，DNA 纯度和浓度与其他报道的方法相似7
13、 ，该方法稳定，无有害试剂。从凝血中得到 DNA 质量较高，方法简便、快速而且可靠，得到的高质量 DNA 适合于临床分子生物学研究，而且在临床检测中，使用本方法从凝血中提取的 DNA 不但足够用于基因检测，还能一血多用，完成血清其他项目检测，因此为临床检测和科学研究提供了很大的方便。参考文献：81 Lahiri D, Nurnberger J. A rapid nonenzymatic method for the preparation of HMW DNA from blood for RFLP studiesJ. Nucleic Acids Res, 1991, 19: 5444.2 M
14、iller S, Dykes D, Polesky H. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cellsJ. Nucleic Acids Res, 1988, 16: 1215. 3 Tas S. Purification of DNA from clotted blood J. Clin Chem, 1990, 36: 1851. 4 赵庆伟, 申萍,周梦玲，等. 从冻藏凝血块中制备 DNA技术J.中国动脉硬化杂志, 1998, 6(3): 257258.5 李宏芬, 沈志霞,刘志忠. 从凝血块中制备 DNA 技术J. 临床检验杂志, 2004, 22(3)：211.96 叶文静，魏然，任道凌，等. 脑栓塞患者的组织纤维蛋白酶原激活因子(tPA) 基因多态性分析J. 泰山医学院学报, 2003, 24: 331332.7 Everson RB, Mass MJ, Gallagher JE,et al. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. Biotechniques, 1993, 15: 1820.
