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1、1从噬菌体表面展示环状 7 肽肽库中筛选葡萄球菌 B型肠毒素抑制剂作者：李韩平，周宏，郑玉玲，邓小红，马茹，姜永强【关键词】 葡萄球菌 B 型肠毒素Screening inhibitor of Staphylococcal enterotoxin B from random circular 7mer peptide library displayed on phage【Abstract】 AIM: To obtain the specific peptide which can bind with SEB and inhibit SEBs enterotoxin activity by pa
2、nning from the random circular 7mer polypeptide libraries. METHODS: The affinity of peptide and the competitive activity of the synthetic peptide with that of antiSEB monoclonal antibody (McAb) were detected respectively by PhageELISA and competition ELISA. Animal experiment was performed to assess
3、the suppressive effect of the screened peptide on the toxicity of SEB and its enterotoxin. RESULTS: The circular 7mer peptide obtained by panning suppressed the multiplication of spleen lymphocytes in mice. At the ratio of 160:1 (SEB: synthetic 7mers peptide), the peptide 2protected the little cats
4、from attack of enterotoxin and the survival rate of mice treated with the screened peptide was significantly higher compared with that of the control group. CONCLUSION: The obtained peptide specifically combines with SEB and suppresses its enterotoxin activity, which paves the way for the developmen
5、t of SEB inhibitors.【Keywords】 staphylococcal enterotoxin B; peptide library; screening; inhibitor【摘要】 目的： 拟通过生物淘选从噬菌体表面展示环状 7肽肽库中筛选出与葡萄球菌 B 型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)结合并能抑制该毒素毒性效应的特异性短肽 . 方法： 采用 PhageELISA 来鉴定所得目的肽的亲和性；利用竞争ELISA 研究合成肽与 SEB mAb 竞争结合 SEB 的情况；通过动物实验考察其抑制 SEB 的超抗原特性和肠毒活性情况
6、. 结果： 筛选所得短肽在一定浓度范围内可以抑制 SEB 对鼠脾淋巴细胞的激活；合成肽与 SEB 质量比 1601下，合成肽可较好地抑制 SEB 对乳猫的肠毒活性，并对 SEB 引起的小鼠致死具有明显保护作用. 结论： 得到了能与 SEB 特异结合并能抑制 SEB 超抗原特性和肠毒活性的短肽.【关键词】 葡萄球菌 B 型肠毒素；肽库;筛选;抑制剂30 引言葡萄球菌 B 型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)1是超抗原(SAg) 家族的主要成员之一，该毒素可以造成食物中毒，严重时甚至导致致死性休克. SEB 中毒后缺乏特异的治疗手段，因此研究 SEB 的特
7、异高效抑制剂具有重大的意义. 我们利用固相筛选方法，即以 SEB 作为亲和靶标蛋白，从环状 7mer 肽噬菌体文库中筛选到与 SEB 结合，并能抑制该毒素毒性效应的噬菌体克隆. 结果表明，所筛选环状 7mer 肽在细胞水平上可抑制 SEB 对小鼠脾细胞的激活，在整体动物水平上对 SEB 导致的毒性具有一定保护作用.1 材料和方法1.1 材料环状 7mer 肽噬菌体文库( Random circular 7mers peptide library displayed on phage)为 New England BioLabsInc 产品; M13 噬菌体单链 DNA 提取试剂盒为 Qiagen
8、 公司产品； SEB 单克隆抗体由本室保存; DGal(D 半乳糖)为 Sigma 产品；抗 M13 噬菌体 mAb、CM Sepharose FF 为 Amesham 产品; BCA 蛋白定量试剂为 Pierce 产品.乳猫 BALB/C 实验动物由军事医4学科学院丰台实验中心提供并饲养.1.2 方法随机肽库的扩增、定量按照所附试剂盒说明书进行；纯化按QIAprepM13 Handbook 进行. 亲和靶标蛋白 SEB 的分离纯化与定量按文献2方法进行 . 依据优势噬菌体阳性克隆序列合成相应的多肽,由军事医学科学院六所合成, 并进行了多肽纯化和脱盐处理,合成多肽的纯度达 95%以上. 将纯化
9、的 SEB 与 0.1 mol/L NaHCO3(pH 8.6)相混合, 制成质量浓度为 1 g/ L 的溶液,取 100 L混合液加于酶联条微孔进行包板固定，于 4过夜；次日弃包被液后，加 200 L浓度为 50 g/L BSA 于酶联孔中进行封闭，37结合 2 h,间隙振荡；弃封闭液，取 100 mL/L TBST 液 200 L洗涤6 次, 间隔为 5 min/次, 然后将 10 L肽库原液加于含有 100 L TBST 的酶联孔中,室温轻摇过夜;次日弃未结合的噬菌体,取 100 ml/L TBST 200L洗涤 10 次,间隔为 3 min/次,最后加 80 L洗脱缓冲液,室温轻柔吹打
10、 10 min 后, 将洗脱得到的噬菌体转入微量离心管中, 立即加入 15 L 1 mol/L TrisHCL(pH 9.1)进行中和. 将所得噬菌体进行感染、扩增、纯化后进行下一轮筛选. 在后续的筛选中TBST 的浓度增为 500 mL/L. 随机挑取第 3 轮噬菌体单克隆进行培养后进行 PhageELISA 分析及 DNA 序列测定. 将 SEB 包被酶联板，经 30 g/L BSA 封闭后加入培养好的单克隆上清，采用 PhageELISA5法检测 SEB 与噬菌体的结合情况. ssDNA 的提取按照QIAprepM13 Handbook 进行，纯化好的 ssDNA 送往上海博大基因公司进
11、行序列测定.1.2.1 活性测定 采用竞争抑制 ELISA 考察多肽与 SEB 的结合情况, SEB 包被量为 25 g. 取 100 g/L mAb 100 L,分别与噬菌体单克隆上清 200, 100, 50, 25, 0 L，其中不足 200 L的以 8.5 g/L NaCl 补齐，然后加兔抗鼠抗体标记的 HRP 显色，A450 nm 比色，观察竞争效果. 结果判断的依据为 A 值下降，说明多肽抑制了mAb 的结合. 以鼠脾淋巴细胞为靶细胞，采用噻唑蓝（ MTT）法评价合成肽对 SEB 超抗原的体外抑制活性.1.2.2 动物实验 幼猫腹腔接种保护实验： 所用幼猫体质量约为 450 g.
12、将纯化 SEB 5 g溶解于 5 mL 生理盐水，制成实验对照用液；合成肽与 SEB 按 1601质量比进行混合用药 . 实验用量为每只 4 mL，在 5 h 内发生呕吐、腹泻者为阳性 . 单纯使用 SEB 的组称为对照组，使用合成肽与 SEB 的组称为实验组. 合成肽对小鼠的保护实验3： 实验所用动物为体质量 1822 g 的雌性BALB/c 小鼠，随机分为 4 组，每组 8 只，分别为单纯使用 SEB 组、使用致敏剂 D 半乳糖（DGal）组、使用 SEB+ DGal+synthetic 7mer peptide 组与使用 SEB+ DGal 组. 合成肽与 SEB 的比例按照1601进行
13、混合用药，SEB 用量 5 g/鼠. 致敏剂 D 半乳糖6（DGal）母液浓度为 20 mg/鼠. 统计学处理： 应用 SPSS 统计软件，利用单样本 t 检验对单克隆原种亲和性进行分析, 合成肽对小鼠的保护抑制利用成组设计多样本比较的秩和检验进行分析，以 P0.05 为有统计学差异. 2结果将本室重组表达的蛋白进行 CMFF 离子交换层析 . 纯化产物进行SDSPAGE 分析，可获得高纯度的 SEB(Fig 1), 为证明噬菌体肽库淘选的有效性，即有富集现象出现，需计算每轮淘选产量，每次加入噬菌体数固定. 通过 3 轮淘选发现，随着淘选次数的增加，出现了富集，噬菌体环状 7 肽肽库第 3 轮
14、比第一轮的产量高出 1.375 倍. 经过 3 轮亲和筛选，随机挑选 14 个分隔良好的单克隆制备原种，进行 PhageELISA 鉴定，以高出阴性对照 5 倍的单克隆作为阳性克隆, 结果如 Fig 2，其中 15 为阴性对照. 对噬菌体单克隆原种 A450进行单样本 t 检验，t0.05/2（13）=2.160t=10.85, P0.05，相对于阴性对照 A450，噬菌体单克隆原种 A450 具有显著性差异. 从以上结果可以看出，经过 3 轮筛选噬菌体得到了明显富集，可见亲和筛选的方法是有效的，已得到与 SEB 特异结合的短肽. 选取 10个阳性克隆进行测序 ，推导出相应的氨基酸序列. 即为
15、噬菌体外源蛋白与噬菌体外壳蛋白融合展示的环状 7 肽 . 通过筛选得到的阳性克隆序列具有很好的一致性，均为 CLPRQSSFC.2 结果72.1 合成肽对 SEB 超抗原作用的体外抑制活性合成多肽的纯度达实验要求，质谱分析测定的分子量与理论值相符，说明合成的多肽结构正确，合乎测试要求，可用于生物学活性的检测和评定. 将与 SEB 高亲和力的噬菌体单克隆原种培养上清做系列稀释，与SEB 单抗进行竞争抑制 ELISA 实验，结果在一定稀释梯度内竞争抑制呈线性上升(Fig 3). 这说明筛选所得短肽与 SEB 结合位点与 SEB mAb 结合位点一致. 以鼠脾淋巴细胞为效应细胞， MTT 法测试，S
16、EB 在低浓度下，合成的短肽抑制效果较为明显，随着 SEB 浓度的递增，这种抑制作用逐渐减弱（Fig 4）.2.2 动物实验结果幼猫腹腔接种后 1 h 左右，对照组出现呕吐、腹泻、精神萎靡、行走困难症状；18 h 后，幼猫开始饮水进食，并恢复好动习性；而实验组则无上述症状的出现. 显示，合成肽可以保护幼猫免受 SEB 肠毒毒性攻击，证明筛选所得环状 7 肽有效. 为进一步证明肽的有效性，将合成的肽与 SEB 混合进行动物实验. 结果如 Fig 5，秩和检验 2=18.459, P 0.05,可认为利用肽进行保护组存活率优于单纯使用 DGal+SEB 组，在用药后的 10 h 内，这种保护作用尤为明显，随着用药时间的延长，保护作用逐渐减弱. 结果证明，筛选所得肽在一定时间范围内对 SEB 具有明显的抑制作用.83 讨论肽库技术是引入组合策略和模拟进化思想，建立起的一种筛选药物先导化合物的新方法. 从噬菌体表位随机肽库中筛选药
