《人类Foxm1b基因的原核表达、抗体制备及其对肝癌细胞中Foxm1b蛋白的识别》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人类Foxm1b基因的原核表达、抗体制备及其对肝癌细胞中Foxm1b蛋白的识别（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1人类 Foxm1b 基因的原核表达、抗体制备及其对肝癌细胞中 Foxm1b 蛋白的识别作者：唐保东， 刘思纯， 徐雅， 曾志荣， 胡品津【摘要 】 【目的】 构建人类 Foxm1b 基因的原核表达载体，表达并纯化蛋白，制备多克隆抗体，并用此抗体检测肝癌细胞中Foxm1b 基因的表达，为进一步研究 Foxm1b 基因的功能奠定基础。【方法】 从 GenBank 中下载人类 Foxm1b 基因全长 cDNA 序列并用 Pcgene 软件分析其可能的抗原表位，设计引物，应用 RT-PCR 获得含抗原表位的 Foxm1b 基因片段，重组入原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌 BL-21(DE3)中
2、诱导表达，应用亲和层析法获得纯度较高的原核表达蛋白并免疫大鼠制备多克隆抗体，用 ELISA检测抗体滴度并用免疫细胞化学的方法检测此抗体对肝癌细胞中天然 Foxm1b 蛋白的识别。 【结果】 成功构建了 Foxm1b 基因重组表达载体 pET-28a-Foxm1b，表达的蛋白经纯化后免疫大鼠得到了高滴度的多克隆抗体，该抗体可以识别肝癌细胞中的天然抗原。 【结论】 人类 Foxm1b 基因的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及有诊断价值的抗体的制备为后续的研究提供了基础。 【关键词】 人类 Foxm1b 基因； 原核表达； 多克隆抗体； 肝2癌细胞Abstract:【Objective】 To
3、 construct prokaryotic recombinant plasmid and express Foxm1b protein, prepare its polyclonal antibody and apply it to recognize the nature antigen in liver tumor cell line. 【Methods】 The full cDNA sequence of human Foxm1b gene was obtained from GenBank and analyzed by PCgene bioinformatics software
4、 to investigate the antigenic determinants. The sequence containing antigenic determinants of human Foxm1b gene was amplified by RT-PCR and recombined into prokaryotic expression vector pET-28a, then transformed into E.coli BL-21(DE3). After induced by IPTG, the recombinant protein was expressed and
5、 purified by affinity purification. The polyclonal antibody was obtained from rats immunized by the recombinant protein and was identified by ELISA. Immuocytochemistry was used to affirm that the polyclonal antibody could recognize the natural Foxm1b protein expressed in liver tumor cell.【Results】Th
6、e recombinant prokaryotic expression vector pET-28a-Foxm1b was constructed and the recombinant protein was purified successfully, and the prepared high titer polyclonal antibody 3could recognize the natural protein in liver tumor cell very well.【Conclusions】 The recombinant prokaryotic expression ve
7、ctor, the recombinant protein and the polyclonal antibody obtained successfully in this study would be applied for further investigation of the Foxm1b gene and liver cancer.Key words：Human Foxm1b gene; prokaryotic expression; polyclonal antibody; liver tumor cell肝细胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC)是人
8、类最常见的恶性肿瘤之一。我国每年约 23 万人死于肝癌，占全球肝癌患者死亡数的 53。许多研究表明，癌细胞的生长、转移同某些基因有关 1。Foxm1b 是一种上调细胞增殖的转录因子，属 Fox 家族，其属于控制包括增殖、成熟、死亡在内的整个细胞生命周期的基因家族之一，与肿瘤生长和转移相关2。研究人员用基因缺失小鼠研究 Foxm1b基因和肝癌的关系，结果显示这个基因的存在对癌细胞增殖至关重要1。本研究试图通过构建 Foxm1b 基因原核表达载体，制备多克隆抗体，并用此抗体检测肝癌细胞中的 Foxm1b 基因的表达，为深入研究肝癌的分子机制奠定基础，为研究进一步 Foxm1b 基因的功能提供条件。
9、1 材料和方法41.1 材 料E.coli DH-5、BL-21(DE3)和人肝癌细胞株 SMMC-7721 由本室保存；SD 大鼠（Sprague Dawley，远交群大鼠）由中山大学中山医学院动物中心提供；载体 pET-28a(+)购自 Novagen 公司；T4 DNA 连接酶为 Promega 公司产品；DNA 纯化回收试剂盒购自赛百胜公司；His Bind Purification kit 购自 Novagen 公司；弗氏佐剂购自 Sigma 公司；DMEM 购自 Gibco 公司； RNA 提取试剂盒购自 Fastagen 公司。1.2 方 法1.2.1 引物设计 在 GenBan
10、k 中获得人类 Foxm1b 基因的全长 cDNA 序列(基因登录号：BC006529) ，用 PCgene 软件分析其可能的抗原表位序列，在主要抗原表位序列区的两侧设计一对引物，并在 5端引入 BamH酶切位点,3端引入 Xho酶切位点。上游引物为：5-GAG GGA TCC ATG ACC ATC AAA ACC GAA CTC CC-3；下游引物为：5-GAG CTC GAG CTG GGA GGC AGG GTC AGA G-3。1.2.2 总 RNA 的提取和目的片段的扩增 用加有 10%胎牛血清的5DMEM 培养基培养人肝癌细胞 SMMC-7721，待细胞长满后用0.25%胰酶消化
11、，离心收集细胞，用 RNA 提取试剂盒提取总mRNA 并立即逆转录为 cDNA。以 cDNA 为模板，用上述 PCR 引物扩增目的片段，PCR 反应条件为：94 预变性 5 min，按 94 1 min、63 50S、72 1 min 的条件进行 35 个循环后 72 延伸 10 min。1.2.3 原核表达质粒的构建及鉴定 PCR 扩增出的目的片段及pET-28a(+)经 BamH 和 Xho 双酶切后，分别纯化回收后 T4 DNA 连接酶 16 水浴连接过夜，转化到 E.coli DH5中，涂布到卡那霉素抗性的 LB 培养板上，37 培养 1216 h，挑选单克隆进行 PCR 及质粒双酶切
12、鉴定，挑选 2 个阳性克隆进行测序，鉴定目的片段的序列及编码框是否正确。1.2.4 原核表达和纯化 将测序鉴定正确的 pET-28a(+)-Foxm1b原核表达质粒转入 E.coli BL-21(DE3)，挑取单克隆接种到含 50 ?滋 g/mL 卡那霉素的 LB 培养基中，37 250 r/min 活化过夜，按1 100 的比例接种于新鲜的含 50 ?滋 g/mL 卡那霉素的 LB 培养基中，37 培养至 OD6000.6时，加 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L，37 诱导 5 h。离心收集菌体，每克菌体加 3 mL 裂解液重悬，超声波破碎菌体，12 000 g 离心力离心，收集上清，
13、纯化表达重组蛋白， 经 SDS-PAGE 鉴定后用 pH 7.4 的 PBS 透析，6Bradford 法测定蛋白浓度。1.2.5 Foxm1b 多克隆抗体的制备及效价检测 纯化后的 Foxm1b蛋白与弗式佐剂等体积混合乳化，腹部皮下多点注射免疫 SD 大鼠。首次免疫用完全佐剂，每只大鼠 200 ?滋 g 纯化蛋白；之后的免疫用不完全佐剂，每只大鼠每次 100 ?滋 g 纯化蛋白。隔周免疫 1 次，共免疫 3 次。第 3 次免疫 2 周后心脏采血得血清，用 ELISA 法测定血清效价，每孔包被有 5 ?滋 g 纯化后的蛋白，血清的稀释度为 1 50 到 1 50 000； 二抗为 HRP-兔抗
14、大鼠 IgG（稀释度为 1 20 000） 。1.2.6 免疫细胞化学鉴定重组 Foxm1b 蛋白抗体对天然抗原的识别 人肝癌细胞 SMMC-7721 传代并爬片于经多聚赖氨酸处理的防脱玻片上，用 4%甲醛 -PBS 固定细胞 15 min，PBS 冲洗玻片后用5%BSA-PBS 4 封闭过夜，再用 PBS 洗 3 次，加入含多克隆抗体的血清（1200）37 孵育 2 h，PBS 洗 3 次后加二抗（HRP-兔抗大鼠 IgG，1 2 000）37 孵育 1 h，PBS 洗 4 次，显色试剂盒显色。2 结 果2.1 目的片段的选择和原核表达质粒构建7用 PCgene 软件分析由 cDNA 推导的
15、人类 Foxm1b 氨基酸残基序列，发现三个抗原表位：氨基酸残基 459-464 位：Arg-Glu-Arg-Arg-Glu-Arg；361-366 ：Pro-Gly-Lys-Glu-Glu-Lys；141146： Glu-Met-Glu-Glu-Lys-Glu。所选择的目的片段包含了前两个抗原表位，长度为 705 bp。目的片段经 PCR 扩增后克隆到表达载体 pET-28a(+)，经双酶切鉴定（图 1）和测序鉴定，证实原核表达载体构建成功，序列与GenBank 中序列一致。2.2 Foxm1b 蛋白的原核表达和纯化结果测序正确的重组克隆经 IPTG 诱导表达和 His 亲和纯化，得到纯度较
16、高的 Foxm1b 蛋白，测定纯化后蛋白浓度为 0.3 mg/mL。经SDS-PAGE 鉴定（图 2） ，在约 27 ku 处出现目的条带，与理论预测分子量（26.15 ku）相一致。2.3 抗体的效价和对天然 Foxm1b 蛋白的识别Western-bloting 结果（图 3）表明纯化所得的重组 Foxm1b 蛋白具有很好的免疫原性。ELISA 测定免疫大鼠所得多克隆抗体的效价为 1:12 800，且能够很好的识别人肝癌细胞 SMMC-7721 中的8天然 Foxm1b 蛋白（图 4） 。3 讨 论Foxm1b 基因在组织器官的发育中起着关键性作用3,4，也在人类的多种肿瘤中呈现转录和表达量的明显增加，是近年来备受关注的研究热点5-7。在肝癌组织中同样出现 Foxm1b 蛋白的高表达，而且表达量的大小可用于判断肝癌的分化程度和患者的预后8。最新的资料显示，以 Foxm1b 基因为靶标的
