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1、1人类 ERMAP 基因在不同胎龄胎儿组织中表达的研究作者：何新荣，何映谊，陈滢，叶铁真【摘要 】 人类 ERMAP 基因是新近发现的编码红细胞膜相关蛋白基因，其功能可能与红系造血活动有关。为探讨该基因在胎儿造血过程中的作用，收集 9-36 周难免流产胎儿共 29 例，分别抽提其肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺脏、胸腺、大脑、骨髓和肌肉等 9 种脏器组织的 RNA，取其中胎龄 25+5 周（25 周过 5 天，下同）的胎儿各脏器组织的 RNA 进行 Northern blot 检测，了解人类 ERMAP基因在胎儿脏器组织中的表达谱，同时采用荧光定量 PCR（FQ-PCR）方法观察该基因在不同胎龄胎儿
2、组织中表达量的变化规律。结果 Northern blot 检测显示，人类 ERMAP 基因在 25+5 周胎儿肝脏和骨髓中表达阳性，而在脾脏、肾脏、胸腺、心脏、肺脏、大脑及肌肉中表达阴性。FQ-PCR 结果显示，人类 ERMAP 基因在 9-36 周胎儿肝脏中均有表达，其表达量从第 12 周开始升高，18-20周达高峰，21 周后逐渐下降；该基因在胎儿骨髓中的表达则从 15周开始，27-32 周达高峰，之后迅速下降，其表达量低于肝脏；在其余 7 个脏器中仅有部分标本呈现低水平表达。结论：人类ERMAP 基因在胎儿肝脏中的表达规律与胎儿肝脏造血过程基本一2致，在 15-32 周胎儿骨髓中的表达规
3、律与胎儿期骨髓造血活动基本吻合，推测该基因的功能可能与胎儿发育过程中红系细胞向肝脏和骨髓的迁移活动有关。 【关键词】 ERMAP 基因；胎儿期；肝脏；骨髓；造血Expression of Human ERMAP Gene in Fetal TissuesAbstractHuman ERMAP (hERMAP) is a novel gene coding for erythroid membrane-associated protein, which may play a role in erythropoiesis. To explore the role of hERMAP in feta
4、l hematopoiesis, 29 fetuses of inevitable abortion with the fetal ages of9-36 weeks were collected, and the total RNAs were isolated from the liver, spleen, kidney, heart, lung, thymus, brain, bone marrow and skeletal muscle, the RNAs from which at 25+5 week fetal age were used to detect hERMAP expr
5、essions in different fetal tissues with Northern blot, and the hERMAP in various fetal tissues were quantified by FQ-PCR. As a result, Northern blot showed that hERMAP was expressed in liver and bone marrow at 25+5 fetal age, but not in the other organ tissues. FQ-PCR results indicated that the hERM
6、AP had been still expressed in 9-36th 3week fetal liver, increased starting from 12th-week, reaching a peak between 18 -20th week and declining slowly starting from 21st-week. In the fetal bone marrow, expression of the hERMAP began from 15th week, reached a highest level between 27-32nd week and fe
7、ll rapidly from 33rd week, the expression level of which was lower than that in liver. The low level expression of this gene was observed in some specimens of kidney, heart, lung, thymus, brain and skeletal muscle. It is concluded that the expression of hERMAP in fetal liver approximately consistent
8、 with haematopoiesis of fetal liver, and the expression of this gene in bone marrow aged 15-32th fetal weeks coincides with haematopoiesis of fetal bone marrow. It suggests that the function of the hERMAP is possibly related with the migration of erythroid cells to liver and bone marrow during the f
9、etal development process.Key words human ERMAP；fetal stage；haematopoiesis近年来，Ye 等1-3 分别从鼠胚胎红细胞和人胎肝 cDNA文库中筛选出编码红细胞膜相关蛋白（erythroid membrane-associated protein，ERMAP ）基因，并证实其高度特异表达于胎4肝、成人骨髓等造血组织以及 K562 和 HEL 细胞系，其编码的蛋白分子定位于网织红细胞和原始红细胞膜、293T 细胞膜和其他胞浆小体上，分析显示其为一跨膜蛋白分子，属免疫球蛋白超家族成员。推测 ERMAP 可能通过细胞间的黏附和（或）
10、识别，影响红系造血，或在红系相关性疾病、 自身免疫性疾病和其他疾病中起一定作用。 目前关于该基因的特性与功能尚待进一步研究。本研究旨在通过观察人类 ERMAP 基因在不同胎龄胎儿各脏器组织中的表达谱及表达量的变化，探讨该基因在胎儿造血过程中的作用。材料和方法材料收集 2004 年 3 月至 2004 年 11 月由广东省妇幼保健院、广州医学院第二附属医院、东山区妇幼保健院、海珠区妇幼保健院等医院妇产科提供的难免流产胎儿，胎龄不限。均排除胎儿先天畸形、孕母遗传性疾病、妊娠期间用药史。胎儿离开母体后立即取肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺脏、胸腺、大脑、骨髓和肌肉 9 种脏器组织，放入冻存管，置于-80冰
11、箱保存。方法5总 RNA 的提取称取 50-100 mg 组织置于研钵中，加入液氮研磨成粉末状，转移至含 1 ml RNA-solv 的离心管中，按照 RNA-sol 试剂（Omega 公司产品）说明书提取 RNA，置于-80保存。用紫外透射灯(Amersham 公司产品)分析其纯度，要求OD260/OD280 值在 1.8-2.0。提取物经 1%琼脂糖凝胶电泳证实为完整 RNA。ERMAP 基因表达谱的 Northern blot 观察选取 1 个胎龄为25+5 周(25 周过 5 天）的胎儿，将上述 9 种脏器组织的总 RNA 在1%琼脂糖凝胶上甲醛变性电泳 3 小时（5 V/cm） ，在
12、紫外分光光度仪下测量 18S、28S 条带到点样孔的距离，利用真空转移仪转膜 2小时。然后以 PCR 方法分别标记 ERMAP 和 -actin 探针（按照PCR DIG Probe Synthesis Kit 试剂盒说明书操作，引物由北京赛白盛有限公司合成） ，ERMAP 引物序列为 5-GAGATGGCGAGTTC TGCT-3 ，5-CACCGTCCTCCCCTTATA-3 ，-actin 引物序列为 5 -CATCTCTTGCTCGAAGTCCA -3，5 -ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3。对照管加入无 DIG 标记的dNTPs。探针变性后进行预杂交及杂交，经过低严谨
13、性和高严谨性洗膜后，加入 Anti-Digoxigenin-AP 孵育 30 分钟，再加入 CDP-Star 显色剂于尼龙膜上，将膜曝露在化学发光成像仪（美国System-genome 公司产品）中检测荧光信号。6ERMAP 基因表达量的 FQ-PCR 检测 5取各脏器组织的总RNA 逆转录制备 cDNA（反应体系参照 Promega 公司试剂说明） 。将已测定浓度的含有 ERMAP 基因 cDNA 序列的 pBluescriptSK+质粒（加拿大 McMaster 大学病理与分子医学系 Dr. David Chui教授赠送）依次 10 倍稀释成 7 个浓度级梯度作为模板，用于建立标准曲线。取
14、同一样品的等量 cDNA 作为 PCR 模板，分别加入ERMAP 及 -actin 的引物、探针以及 TaqMan Universal PCR MasterMix（美国 ABI 公司产品） ，检测 ERMAP 及 -actin 的表达水平，两者之比即为 ERMAP 在各组织中的相对表达量。ERMAP和 -actin 引物与 MGB 探针由上海基康有限公司合成，序列如下：ERMAP primer1：5-CATGTGACGGAGGTGG ACAA-3 ERMAP primer2： 5 -CAGCTTTATGGAGTTT TCCTTTTTCT-3 ERMAP MGB probe：FAM-CTTCTT
15、TCAGACC ATGCTA-MGB-actin primer1： 5-ACGGCCAGGTCATCAC CAT-3 -actin primer2： 5-AAGGCTGGAAGAGTGCC TCAG-3。-actin MGB probe：FAM-CAATGAGCGGTTC CG-MGB。统计学处理基因的相对表达量以SD 表示，采用 Origin Pro 7.5 软件进行资料分析和绘图。7结果人类 ERMAP 基因在胎儿脏器组织中的表达谱Northern blot 显示肝脏和骨髓表达阳性，而脾脏、肾脏、胸腺、心脏、肺脏、大脑及肌肉等表达阴性（图 1） 。胎肝组织 RNA 以 ERMAP 探针杂交
16、后，其阳性条带到点样孔距离为 4.04 cm，推算出目的基因的 mRNA 长度为 3.6 kb，与人类 ERMAP mRNA 长度一致。人类 ERMAP 基因在不同胎龄胎儿组织中表达量的变化FQ-PCR 标准曲线将已测定浓度的含有 ERMAP 基因 cDNA的质粒 pBluescriptSK+依次 10 倍稀释成 108-102 cps/l 等 7 个浓度梯度，经 FQ-PCR 后获得典型的倒“S” 型曲线，可检测到荧光信号的起始循环数（Ct）与模板浓度对数值的相关函数为=3.557Ct+38.152，r2=0.998178。人类 ERMAP 基因在胎儿肝脏和骨髓中的表达量 ERMAP 基因在 9-36 周胎儿肝脏中均有表达，其表达量从第 12 周开始升高，18-20 周达高峰， 21 周后逐渐下降。ERMAP 基因在胎儿骨髓中的表达则从 15 周开始，27-32 周达高峰，之后迅速下降，各阶段的8表达量均低于肝脏（附表，图 2） 。Table.
