《丙氧鸟苷对转TK基因的人外周血单个核细胞的毒性作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《丙氧鸟苷对转TK基因的人外周血单个核细胞的毒性作用（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1丙氧鸟苷对转 TK 基因的人外周血单个核细胞的毒性作用作者：闵凤玲，达万明，魏亚明，欧英贤，罗德春 【关键词】 基因转移 关键词 :基因转移;逆转录病毒载体;单核细胞; 更西罗韦 摘 要: 目的 探讨减少异体干细胞移植中移植物抗宿主病（GVHD） ，同时最大限度提高移植物抗白血病（GVL）效应的有效方法. 方法 采用逆转录病毒介导的基因转移方法将型单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因、绿色荧光蛋白（GFP）基因及抗新霉素（NeoR ）基因插入人外周血单个核细胞（PBMC） ，MTT 法测定丙氧鸟苷（GCV）对转化细胞抑制率. 结果 转化细胞表达 GFP，且主要为 T 淋巴细胞，占 11.
2、4%，而且被转化的 T 淋巴细胞中，CD4阳性细胞转化率较高，占 7.6%，CD8，CD19 ，CD33 阳性细胞转化率分别为 2.9%，2.1%和 4.7%.PCR 鉴定表明，转染的人外周血单个核细胞 DNA 中整合有 NeoR 基因.MTT 法测定丙氧鸟苷（GCV）对转化细胞与未转化细胞抑制率，显示转化细胞生长明显受抑. 结论 异体干细胞移植后，如产生严重 GVHD 应用 GCV 选择性清除 HSV-TK 基因转导的 T 淋巴细胞，使控制 GVHD 已成可能. Keywords:gene 2transfer;retrovidae;monocytes;gancicloir Abstract:
3、AIM To explore the way for decreasing graft ver-sus host disease（GVHD）while preserving graft versus leukemia（GVL）effect maximally in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.METHODS Viral thymidine ki-nase（TK ） gene，green fluorescent protein（GFP）gene and the bacterial neomycin-resistance（N
4、eoR）gene were intro-duced into human peripheral blood mononuclear cells（PBMC）with retroviral vector.The transduced cells growth ability were assayed by MTT.RESULTS Transduced PBMNC showed that major transduced cells were T cells and CD4positive ones took the lead.CD3expression was11.4%，CD4 ，CD8 ，CD1
5、9and CD33expression were7.6%，2.9%，2.1%and4.7%，respectively.In the genome of the infected target cells，integrated NeoR gene was identified by PCR analysis.The transduced cellsgrowth ability was inhibited by gancicloir（GCV ）.CONCLUSION Selectively eliminated TK-transduced T lymphocyte in case GVHD dev
6、elops is pos-sible. 0 引言 3逆转录病毒载体介导的基因转移是近年发展起来的基因转移技术1 .随着干细胞移植治疗恶性血液病的广泛深入，寻求减少移植物抗宿主病（GVHD） ，同时最大限度发挥 GVL 效应的方法是干细胞移植的重要课题之一2 .我们以逆转录病毒载体介导将HSV-TK 基因导入人外周血单个核细胞（PBMC） ，观察其表达及丙氧鸟苷（GCV）对转化细胞的毒性作用. 1 材料和方法 1.1 材料 DMEM 培养基（粉剂） ，由 Gibco 公司出品;rhIL-2 购自北京中化合通药业有限公司，批号 960310;CD3mAb 由军事医学科学院生产;PHA-P，噻唑蓝由
7、 Sigma 公司出品，购自北京天象人生物工程公司;藻红素（ PE）标记鼠抗人CD3，CD4，CD8 ，CD19，CD33mAb 购自深圳晶美生物工程有限公司;GCV 购自罗氏药业有限公司.PA317/GCGFPPT-SN 为含GFP 基因、HSV-TK 基因、NeoR 基因的逆转录病毒包装细胞株、NIH3T3 细胞株，均由上海东方肝胆外科医院钱其军博士惠赠. 1.2 方法 PA317/GCGFPPTSN 包装细胞在含 500mgL-1 4G418 的 DMEM 中培养，培养条件为 37，50mLL-1 CO2 饱和湿化空气中培养.基本成层后，弃上清，换用无 G418 的新鲜培养液继续培养 1
8、824h 后，收集上清，以 NIH3T3 细胞株检测病毒滴度.病毒效价=集落数上清稀释倍数（103 CFUL-1 ）.取健康志愿献血者外周血 58mL，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用生理盐液洗 2 遍，悬浮于 2mgL-1 PHA:10gL-1 CD3 mAb:5105 UL-1 rhIL-2 和 200mLL-1 胎牛血清的DMEM 培养中，置 37，500mLL-1 CO2 的饱和湿度培养箱中培养 35d.取上述培养 35d 的 PBMNC 悬浮于8mgL-1 polybrene，100mgL-1 rhIL-2 的病毒上清，孵育 812h 后，去除病毒上清及 polybren
9、e，加入含200mLL-1 胎牛血清的新鲜培养液，1 2d 后，重复上述步骤，继续与病毒上清孵育、去除病毒上清、加新培养液，如此反复转染 23 次.转染病毒滴度与细胞比为 101. 1.2.1 倒置显微镜观察 取转染后细胞制成细胞悬液，相差镜头下观察，计数视野中细胞数，转换荧光光源，观察 GFP 所发出的绿色荧光，计数荧光细胞数. 1.2.2 FACS 分析 取转染细胞分加于 6 支试管，每管约2105 细胞，一管为阴性本底，其余 5 管分别用 PE 标记鼠抗人CD3，CD4，CD8 ，CD19，CD33mAb 进行细胞表面抗原标记.参5照检测异硫氰酸荧光素（FITC）的常规方法（其激发波长
10、475nm，发射波长 490nm） ，调整流式细胞仪工作条件至 GFP，工作电压525V，各管分别获取 10000 个细胞. 1.2.3 细胞基因组 DNA 提取与外源基因整合鉴定 PCR 检测 NeoR 基因，常规方法进行转染后外周血单个核细胞基因组 DNA 提取，并以此 DNA 为模板，用NeoR 基因引物进行 PCR 扩增（产物 790bp）.P1:5CAA GAT GGA TTG CAC GCA GG3，P2:5CCC GCT CAG AAG AAC TCG TC3.反应条件:95 水浴变性 5min，加 Taq 酶 2.5U，然后进行 28 个循环反应（551min，721min30
11、s，941min） ，接551min，最后 72延伸 10min，PCR 产物经 10gL-1 琼脂糖凝胶电泳鉴定. 1.2.4 GCV 抑制率测定 将转染细胞与未转染细胞 1105 接种于 24 孔培养板，同时加 rhIL-21105 UL-1 ，设阴性对照孔，将0.1，1，10mgL-1 三个剂量 GCV 加入转染细胞孔中，以此为实验孔，每孔设 4 个复孔，培养 72h 后，分别于相差显微镜下观察其形态变化.GCV 对转染细胞生长抑制率采用 MTT 法3，4 ，DG-3022 型酶联免疫仪（南京）测 570nm 的 A 值，按下列公式计算细胞生长抑制率（%）= （1-实验孔 A 值对照孔A
12、 值） 100%.统计学处理:采用 t 检验. 62 结果 病毒上清滴度为 3.75108 CFUL-1 .IX70 倒置显微镜下观察重复转染的人 PBMC，相差镜头视野下可见细胞生长良好，膜光滑完整、胞质丰富、核清晰可见，计数视野细胞约 100 个，转换荧光光源，可见绿色荧光细胞，细胞饱满，计数约 13 个.进一步观察 PE 标记鼠抗人 CD3 mAb 标记的转染后细胞，荧光视野下可见由 GFP 产生的绿色荧光细胞、PE 产生的红色荧光细胞及 GFP和 PE 双标记细胞（Fig1）. 2.1 FACS 测定不同 CD 抗原细胞基因转移效率 Data063 为阴性本底，Data064 ， 06
13、5，066，067，068 为实验组，基因转移效率按实验组 UR 测定值 -阴性本底 UR 测定值计算. 由 Tab1 可见不同 CD 抗原细胞中 T 淋巴细胞基因转移效率较高.转化 T 细胞中 CD4+ 细胞亚群占较大比例，CD8+ 细胞亚群及单核细胞也有一定的基因转移率，B 淋巴细胞基因转移率最低. 表 1 不同 CD 抗原细胞基因转染效率（略） 2.2 外源基因在 PBMC 基因组中的整合 应用 PCR 对转染的 PBMC DNA 进行 NeoR 基因鉴定，结果可见 NeoR 基因 790bp 的 PCR 产物电泳带，表明转染的外周血单个核细胞基因组中有 NeoR 基因整合（Fig2）.
14、 72.3 体外细胞毒试验 在正常条件下，经转化细胞培养 72h 及未经转化细胞加GCV 培养 72h，细胞形态无明显改变，不同 GCV 浓度加入实验孔后，培养 72h，各孔细胞均有形态改变，以 1mgL-1 和10mgL-1 质量浓度剂量改变较显著，表现为细胞整体轮廓模糊，胞膜变形，细胞内出现很多颗粒状物质、纤维状物质及空泡，并有细胞碎片出现，呈死亡状.GCV 对转化细胞在终质量浓度为0.1mgL-1 时即有一定抑制作用，增加药物质量浓度，抑制率有所提高，当药物浓度从 1mgL-1 增加至10mgL-1 时，两者抑制率无显著差异（Tab2）.表 2 GCV 诱导细胞生长抑制率测定（略） 3
15、讨论 异基因骨髓移植后急性或慢性 GVHD 始终是影响患者生存的主要因素.以往常用的有效方法除应用免疫抑制剂外，便是体外去除T 细胞的骨髓移植5 ，但同时也削弱了 GVL 效应.GVHD 的效应细胞是异基因供者成熟淋巴细胞中能够识别宿主主要组织相容性复合体（MHC）抗原的一些克隆细胞，针对宿主靶细胞上的 MHC及次要组织相容性复合体 （MinoHC）抗原发动细胞免疫反应.GVL是决定异基因骨髓移植在白血病治疗中疗效的主要因素.实验结果表明 GVHD 与 GVL 之间密切联系 6 ，但又不是完全重叠.在有些8患者中异基因 T 细胞可以在不导致 GVHD 的情况下发挥 GVL 作用7 . 为了最大
16、限度提高 GVL 效应，防止肿瘤复发，同时减少GVHD 发生，近年来，已开始由过去单一基因治疗肿瘤发展为多基因治疗，对 T 细胞进行基因改造是其中之一.我们利用含 HSV-TK 基因，NeoR 基因、GFP 基因的逆转录病毒载体转染人外周血单个核细胞，以 GFP 基因产物发出的绿色荧光，通过流式细胞仪快速检测，避免了过去通过 NeoR 基因筛选既耗时又易增加污染机会的缺点8 .检测发现经 PHA，CD3mAb 及 IL-2 刺激后被转染细胞主要以 T 淋巴细胞为主，而且被转化的 T 淋巴细胞中 CD4+细胞转染率较高.Sykes 等9，10 的工作表明，CD4 细胞可引起急性GVHD，CD8 细胞导致+60 天以后的慢性 GVHD，但 CD4，CD8细胞协同产生的 GVHD 最为强烈，这提示，异基因骨髓移植后，如发生严重的急性 GVHD，可通过去除转化的 T 淋巴细胞控制GVHD.HSV-TK
