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1、1不同处理和保存条件下体外 HCV RNA 稳定性研究作者：刘长利任芙蓉吕秋霜刘景汉庄辉 【摘要 】 对献血者或病人进行 HCV核酸检测时，如果标本的采集、处理、保存不当，会造成病毒核酸降解，从而影响检测结果的真实性。本研究的目的是对不同抗凝剂、不同温度、不同保存时间下的 HCV RNA病毒稳定性进行研究，以考察常规采供血过程中，标本采集及保存方式对 NAT检测的影响。 采集 7例 HCV RNA阳性献血者的血样，采用不同的抗凝剂、经不同的温度和不同的时间保存后，采用荧光定量 PCR方法测定 HCV RNA病毒含量，考察 HCV RNA的稳定性。 结果表明： 不同抗凝剂抗凝的全血于 4保存 4
2、8小时过程中, 病毒含量下降至原滴度的42.7%；EDTA 抗凝组各时间点的滴度均低于其它 3组（分别相当于其它 3组的 67.6%-25.1%） 。ACD 抗凝的全血在 4、25 和37保存 48小时，病毒含量分别下降到原滴度的53.8%、72.5%、29.8%。ACD 抗凝的全血离心分离出血浆，4或 25继续保存 7天,病毒含量分别下降至原滴度的 70.9%和25.1%。ACD 抗凝的全血分离的血浆，反复冻融 4次，病毒含量下降到原滴度的 38.9%。 结论： 用于核酸检测的标本应该用无菌采血管采样；在无菌采血管采样的前提下，核酸检测标本用未2抗凝血、EDTA、ACD、CPDA 抗凝血均可
3、；采集的全血应避免放置 37以上，ACD 抗凝全血在 4 、25保存 48小时内、37保存 14小时内,HCV RNA病毒仍较为稳定； 分离后的血浆应避免放置 25以上，ACD 抗凝全血分离后的血浆在 4 保存 7天，25 保存 3天，HCV RNA病毒仍比较稳定；血浆标本应避免多次冻融，但冻融 3次的血浆 HCV RNA病毒含量仍然较为稳定；无菌采样对维持病毒的稳定性非常重要；单纯的机械性溶血并不会明显导致病毒的降解；只要注意无菌的问题和有合适的核酸提取方法去除血红素，HCV RNA病毒实际上比以前认为的要稳定得多。 【关键词】 丙型肝炎病毒； 丙型肝炎病毒 RNA； 病毒稳定性；保存条件；
4、 抗凝剂Stability of Hepatitis C Virus RNA in Various Processing and Storage ConditionsAbstractThe study was purposed to investigate whether processing and storage conditions might influence the stability of the HCV RNA in whole blood or in plasma. The samples obtained from seven patients known to be po
5、sitive for HCV RNA were kept in different storage conditions with different anticoagulants, and at the end of processing the 3plasma samples were frozen at -80 until fluorescent quantitative PCR testing. The results showed that there was no significant loss of HCV RNA titers in whole blood anticoagu
6、lated with CPDA or ACD or EDTA or none（P0.05）, while diffe-rences in comparison of the EDTA-anticoagulant storage condition with three other anticoagulants storage conditions at 4 after 48 hours were significant （P0.05）. The HCV RNA level decreased to 53.8%,72.5% and 29.8% after 48 hours of storage
7、of whole blood anticoagulated with ACD at 4, 25 and 37 respectively. The HCV RNA level of plasma samples stored at 4 and at 25 (room temperature) after 7 days decreased to 70.9% and 25.1% respectively. After four freeze-thaw cycles the HCV RNA level decreased 38.9% in plasma samples. It is concluded
8、 that the HCV RNA is stable relatively. The HCV RNA is resistant to degradation under routine laboratory handling and storage conditions or blood collection, transport and processing conditions. The influence of different anticoagulants on the stability of HCV RNA is different. Blood samples would b
9、etter be stored at 4 after collection and plasma separated within 48 hours. And it is important for the stability of HCV RNA undergoing asepsis 4blood collection process. HCV RNA remains stable at 4 for at least 7 days or at room temperature for 3 days, allowing greater flexibility in samples collec
10、tion and transport in transfusion practice nowadays. HCV RNA in plasma samples subject to up to three short-term freeze-thaw cycles is still stable.Key words HCV; HCV RNA; virus stability; storage condition; anticoagulant血浆中 HCV RNA病毒含量测定通常被用于评估丙型肝炎病人的疗效及分析预后等。对于检测结果的准确性来说，标本的采集、处理、保存是否得当是非常重要的。一般认为
11、，RNA 病毒离体后容易受到外界环境的影响而降解，因此对样品的处理方式、保存温度、时间、是否溶血等都有较高的要求。核酸检测技术已在许多国家的献血员血液筛查中应用，我国一些血液中心也在陆续进行一些核酸检测可行性和必要性的评估工作。但目前，对于 HCV RNA样本的采集、处理、保存稳定性研究缺乏全面的报道，尤其是针对在采、供血机构中用于核酸检测血液筛查标本的采集、处理、保存的标准未见报道。在本研究中，我们对不同抗凝剂、不同时间和温度条件下处理和保存的 HCV RNA病毒进行定量测定，以探讨影响体外RNA病毒稳定性的因素。5材料和方法样本来源血液样本来自 2003年到 2004年北京血液中心无偿献血
12、的献血者中 7例 HCV RNA阳性且未经过治疗的无偿献血者。样本采集按照常规献血员血液采集的标准操作规程和方法采集 HCV RNA阳性者血液约 100 ml，分别用 ACD、CPDA 、EDTA 抗凝或不抗凝（未抗凝血） 。采集后的血液立即移至百级净化台内进行无菌分装，将 3种抗凝血分装于 2 ml无菌 Ep管中，每管 1.0 ml，用于用不同抗凝剂采集血液、不同时间分离血浆（血清）及不同温度保存全血的研究。将分装完时作为 0小时对照。同时将一部分 ACD抗凝血置于 50 ml无菌离心管中（美国 Corning公司产品）,25放置 6小时后 1 000g离心 10分钟分离血浆，然后分装于 1
13、.5 ml无菌 Ep管，每管 0.5 ml，用于不同温度保存的血浆及反复冻融血浆处理的研究。以上样品处理操作均为无菌操作。样本处理6不同抗凝剂采集和保存的全血将未抗凝的血和CPDA、EDTA、ACD 抗凝血置 4冰箱中静止保存，于1、3 、6 、 12、24、48 小时各取 2管（Ep 管） ，颠倒混匀 3次后，4 1 000g离心 10分钟分出血浆或血清。此外CPDA、EDTA、ACD 抗凝血于分装后即刻离心分出血浆，作为 0小时对照。 -80 冻存，等待统一检测。不同温度保存的全血选用 ACD抗凝全血，分别保存于 4冰箱、25水浴、37水浴，然后于 1、3 、6、12、24 、48 小时各
14、取 2管，颠倒混匀 3次后，4 1 000g离心分出血浆或血清， -80冻存，等待统一检测。不同温度保存的血浆选用 ACD抗凝血 25 保存 6小时离心后分装的血浆，于 4 、25继续保存 1、3、5 、7 天， -80冻存，等待统一检测。冻融处理选用 ACD抗凝于 25保存 6小时离心后分装的血浆，做 1-4次冻融处理，冻融条件： -80冻存至少 1天；室温 1小时，颠倒混匀后，放入-80。 -80 冻存，等待统一检测。RNA病毒含量检测7使用 Roche核酸提取柱提取核酸，用深圳匹基公司 HCV荧光定量 PCR检测试剂盒和美国 Research公司的 Opticon 荧光定量 PCR检测仪
15、进行扩增和检测。为避免核酸定量存在批间差异，每例 HCV RNA阳性献血者的所有处理样品均在同一次 Run中进行。核酸提取使用 Roche核酸提取柱，按试剂盒说明提取核酸。 每个 2.0 ml离心管中加入 200 l待检测样本，各加入 200 l结合缓冲液（ binding buffer）工作液及 50 l蛋白酶 K溶液，迅速混合均匀，于 72温浴 15分钟（HB-1000 型恒温金属浴，杭州大和公司 FerroTec产品） 。各管中加入 125 l异丙醇，混合均匀，转入加套管的提取柱，8 000g离心 1分钟。将装有滤出液的套管丢弃，换上新套管，向提取柱中加入 500 l除抑制物缓冲液（ i
16、nhibitor removal buffer）工作液于 8 000g离心 1分钟；换上新集液管，向提取柱中加入 450 l洗涤缓冲液（wash buffer）工作液于 8 000g离心 1分钟；换套管，再次用 450 l洗涤缓冲液工作液洗涤后，首先以 8 000g离心 1分钟，然后 13 000g离心 10秒以去除痕量的洗涤缓冲液。每个提取柱换上 1.5 ml离心管，室温放置3分钟，向提取柱中加入 50 l洗脱缓冲液（ elution buffer） ，于8 000g离心 1分钟收集滤出液，于 4保存备用。核酸扩增和检测采用深圳匹基公司 HCV荧光定量 PCR检测8试剂盒，美国 Opticon 荧光 PCR仪进行检测。按试剂盒要求配制反应液。每个反应体系含： HCV RT-PCR反应液 29.6 l, Enhancer 0.4 l, RT-PCR逆转录酶
