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1、1一氧化氮合成酶和心钠素在豚鼠耳蜗的分布【关键词】 心钠素;,一氧化氮合成酶 ;,免疫荧光双标染色摘 要 目的: 观察豚鼠耳蜗局部心钠素（ANP）和一氧化氮合成酶（NOS）免疫组化反应产物的分布及其相互关系, 为研究ANP 和 NOS 在豚鼠耳蜗局部血流、 淋巴以及神经调节中的相互作用提供形态学研究的依据。方法: 采用免疫荧光组织化学双标法观察 ANP 和 NOS 在正常豚鼠耳蜗的分布特征。结果: 在耳蜗各转螺旋动脉和血管纹均发现 ANP 和 NOS 双阳性表达, 螺旋缘、 螺旋韧带和 Corti 器, 耳蜗神经节细胞有 ANP 和 NOS 双阳性染色。结论: ANP 和 NOS 的分布特点显
2、示, 二者在内耳血流调节, 内、 外淋巴平衡调节以及神经信号传递等方面可能存在密切的相互作用。关键词心钠素 ; 一氧化氮合成酶; 免疫荧光双标染色对一氧化氮（nitric oxide, NO）的研究表明, 其作为一种强有力的血管扩张因子, 存在于豚鼠耳蜗血管内皮、 神经节细胞及毛细胞中, 通过直接激活 ATP 敏感的钾离子（KATP）通道使豚鼠蜗轴螺旋动脉（spiral modiolar artery, SMA）的内皮及平滑肌细胞浓度依赖性地去极化, 引起血管扩张1。NO 合成的关键酶一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase, NOS）主要分布于内外毛细胞、 2蜗神经节细胞及
3、耳蜗血管纹1。心钠素（atrial natriuretic peptide, ANP）也具有强大的扩张血管、 增加组织血流量及调节局部组织水电解质平衡等作用。ANP 在内耳分布于螺旋韧带、 Corti 器、 螺旋神经节、 血管纹及 SMA 等处, 参与调节耳蜗血流与内耳微循环平衡状态2。本实验我们采用免疫荧光双标的方法研究 NO 与 ANP 在内耳结构中的分布特点 , 探讨 NO 与 ANP 对耳蜗局部环境的影响及其相互间作用。1 材料和方法1.1 材料 健康红目白色豚鼠 , 雌雄不限 , 体质量 250350 g, 购自第四军医大学实验动物中心。兔抗大鼠 uNOS 多克隆抗体为 labvis
4、ion 公司产品, 小鼠抗人 ANP 单克隆抗体（mAb ）为Chemicon 公司产品, 购于晶美生物工程有限公司。Cy3 标记羊抗兔 IgG 为 Sigma 公司产品 , FITC 标记山羊抗小鼠 IgG 为中杉金桥公司产品, 购于武汉博士德生物公司。1.2 方法1.2.1 组织标本制备 豚鼠 5 只, 戊巴比妥钠（ 60 mg/kg, 腹腔注射）麻醉后开胸, 经升主动脉灌注生理盐水 300 mL 冲出血液, 用 40 g/L 多聚甲醛 500 mL（4）灌注固定 1 h。取双侧耳蜗, 刺3破圆窗膜,置于上述固定液中过夜; 后置于 100 g/L EDTA（25）脱钙 714 d, 移入
5、250 g/L 蔗糖缓冲液 46 h 后, 用 OCT 包埋, 平行蜗轴 10 m 进行连续冰冻切片备用。1.2.2 免疫荧光染色 冰冻切片滴加 1500 稀释兔抗大鼠uNOS 多克隆抗体, 4 孵育 24 h; 甩去玻片多余液体, 直接添加1500 稀释小鼠抗人 ANP mAb, 4孵育 24 h。001 mol/L PBS（pH74）洗 3 次 , 避光同时添加二抗（稀释度均为 1100）, 37孵育 30 min 后, 避光条件下 001 mol/L PBS 洗 3 次, 共聚焦显微镜下观察并拍照。2 结果镜下可见, 在耳蜗各转的血管纹均有 ANP 和 NOS 分布（图1） 。耳蜗各转螺
6、旋韧带可见 ANP 和 NOS 较多分布（图 1） 。在窝轴螺旋动脉, 主要分布在血管内膜（图 1、 2） 。耳蜗各转 Corti 器中毛细胞及支持细胞可见二者分布（图 1） 。另外, 螺旋缘（沟状垫）亦可见二者分布（图 1、 2） 。前庭膜及盖膜均无分布（图 1） 。可见耳蜗各转神经节细胞及其相应神经纤维束分布量较多, 有少数单纯绿色荧光为主的神经细胞（图 2） 。3 讨论4有研究认为, NO 主要通过上调第 2 信使 cGMP 的表达, 使平滑肌细胞内平滑肌纤维舒张, 从而扩张 SMA3。已知 ANP 主要通过与 ANP 受体相结合后催化胞膜型鸟甘酸环化酶（GC）产生大量cGMP, 从而影
7、响离子通道、 蛋白激酶等 , 发挥相应信号调节功能4。Rachel 等5研究发现 ANP 可增加前庭的血流量, 并有剂量依赖性, 同时 ANP 的舒张血管作用也依赖于 cGMP。血管纹 ANP 和NOS 的大量分布, 提示 ANP 和 NO 可能在此处发挥对局部血流量及蜗管中内淋巴液平衡的调控作用。螺旋韧带 ANP 和 NOS 共同分布, 说明 ANP 和 NO 可能作用于螺旋韧带引起局部微结构变化, 而参与局部体液平衡及内淋巴的调节过程。在 Corti 器中的 Corti 淋巴与外淋巴成份相似, 因支持细胞间的紧密连接而与内淋巴分隔。图 1 ANP 和 NOS 在耳蜗的分布（间接免疫荧光染色
8、, 200） （略）A: Cy3 标记（ NOS 分布）, B: FITC 标记（ANP 分布）, C: Cy3、 FITC 双标记（红色荧光示 NOS 分布, 绿色荧光示 ANP 分布, 黄色荧光为二者共表达）.图 2 ANP 和 NOS 在螺旋神经节的分布(间接免疫荧光染色, 200） （略）5A: Cy3 标记（ NOS 分布）, B: FITC 标记（ANP 分布）, C: Cy3、 FITC 双标记（红色荧光示 NOS 分布, 绿色荧光示 ANP 分布, 黄色荧光为二者共表达）.本实验中我们观察到在支持细胞和螺旋缘均可见 NOS 和ANP 分布, 此结果显示 NO 和 ANP 可能通
9、过调节支持细胞膜电位, 或通过改变细胞骨架形态而影响细胞间隙进而影响内淋巴的代谢3, 5。Sabrane 等6认为, ANP 通过引起内皮释放 NO 而发挥血管扩张作用。Madhani 等 7研究发现: 大动脉和肠系膜小动脉ANPcGMP 通路受 NOcGMP 水平调节, 同时内皮源性 NO 的释放受局部 ANP 浓度的影响。可以说, ANP 是通过其特有的方式影响NO 的合成和释放, 并通过 NO 的介质作用, 至少部分通过 NO 作用, 参与血管舒张, 排钠利尿等调节作用。但 ANP 和 NO 在耳蜗血流调节和内淋巴生成调节中的相互作用机制尚不明确, 仍需进一步研究。已有研究证实 NO 作
10、为一种非经典神经递质发挥着信息传递等作用3。ANP 是多肽类信号分子,也发现在中枢神经广泛分布 , 提示其在神经信号传递中可能有一定的作用。对谷氨酸（glutamic acid, Glu）的研究认为, Glu 主要从突触前膜释放 , 引起突触后膜去极化、Ca2+内流, 从而激活 NOS, 催化产生 NO; NO 再与胞内型 GC 结合, 上调 cGMP 水平, 进而发挥信号传递的作用8 。NO 与 ANP 都会引起胞质内 cGMP 及 Ca2+浓度的改变9, 从而影响 ATP 敏感的K+通道, 改变细胞膜电位水平, 提示其二者可能参与毛细胞兴奋性6的调控, 参与 Glu 介导的听觉神经传入等过
11、程。蜗神经节细胞和轴突可见 NOS 分布, 说明 NO 在听觉传递中有重要作用。同时实验观察到在蜗神经节细胞 ANP 大量分布, 提示 ANP 可能在神经细胞水电解质平衡或者信号传递中也有重要作用。实验中存在 ANP 阳性表达为主的神经细胞, 高度提示 ANP 在神经传递过程中具有独特的作用。因此, 神经节细胞中的 ANP 是否由神经细胞自己生成, ANP 在神经细胞中是否存在重要功能仍需进一步研究。总之, NOS 和 ANP在耳蜗组织中分布广泛, 且分布位置相似, 提示二者在耳蜗局部血流调节、 淋巴液平衡、 微环境调节以及神经信号传导中有较为重要的作用, 但对于它们之间潜在的相互影响机制目前
12、尚不明确, 仍需进一步的研究。参考文献:1 李学昌. 一氧化氮、 一氧化氮合酶及其与内耳的关系J. 国外医学耳鼻咽喉科学分册 , 2000, 24(3): 160-164.2 陈合新, 史剑波, 邱建华, 等. 心钠素免疫反应在豚鼠耳蜗中的整体分布J. 中国临床解剖学杂志 , 2002, 20(4): 290-291.3 Si JQ, Zhao H, Yang YQ, et al. Nitric oxide induces hyperpolarization by opening ATPsensitive K channels in 7guinea pig spiral modiolar ar
13、teryJ. Hear Res, 2002, 171: 167-176.4 Garg R, Pandey KN. Regulation of guanylyl cyclase/natriuretic peptide receptorA gene expressionJ. Peptides, 2005, 26(6):1009-1023.5 Rachel JD, Dziadziola JK, Quirk WS. Atrial natriuretic peptide participates in the regulation of vestibular blood flowJ. Hear Res,
14、 1995, 89(1-2): 181-186.6 Sabrane K, Gambaryan S, Brandes RP, et al. Increased sensitivity to endothelial nitric oxide (NO) contributes to arterial normotension in mice with vascular smooth muscleselective deletion of the atrial natriuretic peptide (ANP) receptorJ. J Biol Chem, 2003, 278(20): 17963-
15、17968.7 Madhani M, Scotland RS, MacAllister RJ, et al. Vascular natriuretic peptide receptorlinked particulate guanylate cyclases are modulated by nitric oxidecyclic GMP signallingJ. Br J Pharmacol, 2003, 139(7): 1289-1296.88 Simard M, Nedergaard M. The neurobiology of glia in the context of waterandionhomeostasisJ.Neuroscience,2004, 129(4):877-896.9 韩 捷, 范 云. 整合素信号对离子通道的影响J. 细胞与分子免疫学杂志, 2002, 18(6): 662-663.
