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1、1RPHPLC法同时测定大鼠血中甘草甜素和甘草次酸作者：王骊丽 ，任平，黄熙 ，张莉 ，黄敬群 ，陈建宗 ，陈晓莉 【关键词】 甘草甜素 关键词: 甘草甜素;甘草次酸; 色谱法，高压液相 ;血浆 摘 要: 目的 建立一个同时测定甘草甜素、甘草次酸血浆浓度变化监测的方法，进一步用于“脾主药动学”假说的验证. 方法 采用内标定量的反相高效液相色谱法，以甲醇-水-醋酸（88111 ）为流动相，ODS-3 柱（150mm4.6mm， 5m）为固定相，在紫外 250nm 检测. 结果 GL，GA 在此线性范围内，线性关系良好、精密度较高. 结论 本方法具有简便、灵敏、快速而准确的特点，适用于注射 GL
2、制剂或口服中药复方前后 GL 和 GA 的体内、体外的药代动力学研究，为进一步进行中药复方的药物监测奠定了基础. Keywords:glycyrrhizin;glycyrrhetinic acid;chromatogra-phy，high pressure liquid;plasma Abstract:AIM Establishment of method for measuring plasma concentration of the glycyrrhizin and glycyrrhetinic 2acid simultaneously by RP-HPLC，in order to te
3、stify the hy-pothesis of pharmacokinetics by traditional Chinese medicine.METHODS RP-HPLC with internal labeling was employed.Methanol-H2 O-acetic acid（88111 ）was used as mobile phase and ODS-3（150mm4.6mm，5m）column as fixed phase，and detected by UV（=250nm ）.RESULTS With-in the linear range the glycy
4、rrhizin and glycyrrhetinic acid showed good linear relation and were detected with high precision.CONCLUSION Method is characterized by high sim-plicity，rapidity ，and sensitivity，and is suitable for the in vit-ro and in vivo pharmacokinetic study of glycyrrhizin and gly-cyrrhetinic acid after oral a
5、dministration or injection of GL extracts. 0 引言 四君子汤为治疗脾虚证的经典名方，其主要成分之一为甘草甜素（glycyrrhizin，GL ） ，在体内主要是以其代谢物甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）的形式被吸收，分布到各个组织器官，最终以 GA 的形式排出体外1 .甘草甜素和四君子汤被我们用作验证“脾主药动学”假说2，3 的主要工具方.关于制剂和大鼠血中 GL，GA 测定的 HPLC 法已见报道4-7 ，在我室以前甘草3甜素血药浓度测定（待发表）的基础上，为进一步验证假说的可靠性及其进行方剂治疗药物监测8-10 可能性，同
6、时测定甘草甜素及其代谢产物 GA 的血药浓度是十分必要的.由此经过反复实验，建立了同时测定 GL 和 GA 的反相 HPLC 法.其结果快速、准确、重现性好，可用于注射 GL 制剂或口服中药复方前后的 GL 和 GA 药物动力学研究. 1 材料和方法 1.1 材料 美国 Waters 公司产 HPLC 系统（600 泵，996 二极管阵列检测器，7725 手动进样器） ，M32 色谱工作站，Digital 计算机;TGL-16 台式离心机（上海医用分析仪器厂）.甘草酸铵（中国药品生物制品检定所）;联苯、甲醇等试剂为分析纯（西安化学试剂厂）.雄性 Wistar 大鼠 5 只，体质量（20010）
7、g ， （12.01.5 ）wk 龄（本校实验动物中心提供）. 1.2 方法 1.2.1 色谱条件 色谱柱 C18 柱（Intersil:ODS-3，150mm4.6mm，5m）; 流动相:甲醇-水-醋酸=88111 ，流速:qv=1.0mLmin-1 ，检测波长 :=250nm;进样量为420L. 1.2.2 对照品溶液 分别称取甘草酸铵、甘草次酸对照品 4.10mg，4.10mg，各于 10.0mL 容量瓶中，以甲醇 :H2 O（9010，V/V）溶解成浓度为0.410mgmL-1 ，0.410mgmL-1 . 内标溶液联苯为内标物，浓度为 18.05mgmL-1 . 1.2.3 血浆的干
8、扰分析 大鼠空白血浆:来源于健康雄性 Wistar 大鼠体质量（20010）g眼球摘除取血浆.空白血浆的测定:取 400L 甲醇，置于 1.0mL 的离心试管中加入 100L 空白血浆，用电动混匀器 30s混合后，静置 3min，在台式离心机上以 3880g 离心 10min，取上清移入一次性试管中，20L 进样测定. 在上述色谱条件下，空白血浆色谱峰不干扰测定.再进行 GL，GA 以及内标物联苯的的对照分析，方法同前其色谱峰保留时间（Fig1）. 2 结果 2.1 标准曲线及线性考察 根据实验的需要，GL 进行了高、低组不同浓度范围的工作曲线制作.以高浓度为例，当 （GL）=410mgL-1
9、 5，（GA ） =410mgL -1 .加入体积量按 Tab1（n=5 ）:然后依照 1.2.3 的处理方法得到样品. 各样品同一质量浓度下测定 3次，取其平均值，以对照品峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，进样量（g ）为横坐标进行回归（Tab2 ）. 表 1 标准曲线制作加入样品体积量（略）表 2 标准曲线参数结果（略） 由上表结果表明，GL ，GA 在此线性范围内，线性关系良好. 2.2 日内精密度的考察 将样品溶液 GL 在3.691476mgL-1 ，GA0.39361.5744mgL -1 的浓度范围内重复进样 3 次（n=6 ） ，取平均值计算日内变异系数（Tab3）. 日间精密度
10、的考察，取同一批样品，按不同天数 测定（n=3）日间变异系数（ Tab3）.测定结果本法精密度较好 .以标准曲线求得理论 Y 值，实际所测 GL 面积与内标面积比为测定值，二者相比求得从大鼠血浆中 GL 和 GA 平均相对回收率（Tab3）.表 3 回收率和精密度结果（略） 3 讨论 从二维、三维图谱相互观察，通过与 GL、GA 标准品在相同6条件下对照，保留时间一致，GL 为 3.209，GA 为 6.587（Fig1 ）;可准确对其吸收峰定性分析，GL 的最大吸收峰为 250nm，GA 为247nm（Fig1）. 由于 GL，GA 都是水溶性成分，在预处理中采用了经典的甲醇除蛋白方法，可一
11、步进行甘草甜素、甘草次酸血中蛋白的去除，从图谱观察并没有干扰且去除率很好（Fig1）.本方法的建立能快速、准确的同时测定 GL 和 GA，保留时间无干扰. 研究脾虚证的传统方法是寻找脾虚证的客观指标，再观察经典名方对上述客观指标的作用.即从药物对机体的作用（药效法）角度研究证本质8-10 .在“辨证药动学” 11-14 基础上发展起来的脾主药动学假说 2-3 ，提倡从机体对药物（动力学）处置角度研究证 15 ，甘草甜素及其四君子汤是验证该假说的良好工具，因此，本实验同时测定甘草甜素和甘草次酸的方法建立为深入验证脾主药动学奠定了基础. 在测定大鼠口服甘草甜素的血中浓度研究发现，其甘草甜素和甘草次
12、酸的浓度变化比较大，特别是甘草甜素的浓度变化，因此我们分别进行了高浓度组和低浓度组共同测定，可得到甘草甜素高、低两组回归曲线，使这个结果可广泛用于动物、人注射 GL 制剂或口服中药复方前后的 GL 和 GA 药物监测. 参考文献: 1Wang LL，Huang X，Zhang L.Pharmacokinetics 7of glycyrrhizin J.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi（World Chin J Digestol） ，2000;8（5）:567-569. 2Ren P，Huang X.“Spleen”and Pharmacokinetics:Theoreti
13、cal and experimental basis J.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi（World Chin J Digestol） ，1999;7（12）:1077-1080. 3Huang X，Ren P.Discussion about traditional chinese medicine spleen govern pharmacokinetics J.Chengdu Zhongyiyao Dax-ue Xuebao（J Chengdu Univ Trad Chin Med） ，2000;23（1） :5-6. 4 Wang GH，Zhang WH，Zha
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15、ng Yaoke Daxue Xuebao（J Shenyang Pharm Univ） ，1999;16（ 2）:107-109. 6Zhang L，Huang X，Wang LL.Determination of glycyrrhizine in rat plasma and pharmacokinetics after oral administration J.Zhongcaiyao （J Chin Med Mater） ，82000;23（ 9）:563-565. 7Ma B，Zhang Q，Wang XL，Xiao J.Simultaneous identification of
16、glycyrrhiza and citrus in traditional Chinese patent medicine by RP-HPLC J .Huaxi Yaoxue Zazhi（Huaxi Pharm J） ，1999;14 （3）:157-158. 8Ren P，Zhang L，Huang X，Wang LL，Feng JH，Zhou QN.Study on relationship between pharmacokinetics characteristics of glycyrrhizin and gastrointestinal motivity in rat model of spleen deficiency syndrome J.Anhui Zhongyi Xueyuan Xuebao（J
