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1、1Genistein 对人乳腺癌细胞体外侵袭能力的抑制作用作者：焦敏南克俊雷燕张茜孙海凤 【摘要 】目的：研究金雀异黄素(genistein)对人乳腺癌细胞株MDAMB231体外侵袭能力的影响并探讨其机制.方法：采用细胞体外侵袭实验系统，观察 genistein 对乳腺癌细胞体外侵袭能力的影响；应用 WesternBlot 检测药物作用后 MMP2,MMP9蛋白表达的变化，采用明胶酶谱分析法对药物作用前后乳腺癌细胞分泌的 MMP2,MMP9活性进行分析. 结果：在药物作用24，48，72h 后，15mol/L 组和 30mol/L组侵袭至 Matrilgel滤膜下的细胞数分别为（24512 ）
2、个， （30020）个，（37818）个和（15520）个， （20430）个， （25634）个，较空白对照组显著减少(P0.05).WesternBlot 结果显示，在药物作用 48h 后，0，15，30mol/L 组的 MMP2蛋白相对值分别为0.710.07，0.320.06 和 0.120.03；MMP9 的相对值分别为0.920.06，0.630.04 和 0.240.02.明胶酶谱分析结果显示，15，30mol/L 组基质金属蛋白酶活性显著降低 (P0.05).结论：genistein 有效抑制乳腺癌侵袭和转移，其作用机制可能与降低乳腺癌细胞运动能力，抑制 MMP2，MMP9 表
3、达水平与活性有关. 【关键词】乳腺肿瘤；染料木黄酮；侵袭；基质金属蛋白酶类 20 引言 金雀异黄素（genistein）是一种植物来源的异黄酮化合物，是大豆中重要的非营养成份，对人乳腺癌细胞、肝癌细胞等多种肿瘤细胞具有体外抗增殖作用1 ，但有关 genistein 对乳腺癌侵袭转移作用的研究尚少见报道.本研究以人乳腺癌 MDAMB231细胞株为研究对象，观察 genistein 对其侵袭转移的作用并探讨可能的分子机制，为 genistein 应用于肿瘤临床治疗提供实验依据 . 1 材料和方法 1.1 材料雌激素受体阴性乳腺癌细胞株 MDAMB231(美国模式菌种收集中心 ATCC 细胞库)；g
4、enistein，明胶（美国 Sigma 公司）；鼠抗人 MMP2，MMP9mAb （北京中山生物工程公司） ；DMEM 培养基（美国 Gibco 公司） ；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司） ；Q550IW 图像分析仪( 德国 LEICA 公司). 1.2 方法 1.2.1 体外细胞侵袭实验在 24 孔培养板中放入 Transwell 小室( 装有聚碳酸酯微孔滤膜，孔径 8m)，将基质胶用无血清 DMEM 培养液按 120稀释后，取 100L包被 Transwell 小室底部，无菌风干.下室内加入 800LDMEM培养液.将含有 5.0103 个MDAMB231细胞的悬液接种于上室，
5、加入药物 genitein 使其终浓度分别为 0，15，30mol/L，37孵育 24，48 ，72h 后，取出 Transwell 小室，0.01mol/L ，pH7.2PBS 淋洗，棉签擦拭微孔膜上层，将已经侵入并贴附于微孔膜下层的细胞固定于 20g/L 多聚甲3醛中 30min，Giemsa 染色后进行细胞计数 . 1.2.2WesternBlot 检测乳腺癌细胞株 MDAMB231传代于100mm 的培养皿中，待细胞贴壁后，分别加入浓度为0，15 ，30mol/L 的 genistein，作用 48h 后，分别提取细胞总蛋白分析.细胞用冷 PBS 洗涤 2 次，用 300LRapa裂解
6、液裂解细胞，细胞裂解物-80 过夜，然后刮取细胞，以 12000g，4离心15min，收集上清移入新的 1.5mL 离心管中，考马斯亮兰法定量样本蛋白浓度.依据测定蛋白浓度，取 20g总蛋白进行100g/LSDSPAGE胶电泳，然后电转移至 NC 膜上.用含有 50g/L去脂奶粉的 TBST(TBS+1g/L 吐温-20) 封闭 1.5h；分别加入一抗MMP2， MMP9mAb(各按 1250稀释)，孵育 2h，TBST 漂洗30min；HRP 标记羊抗鼠 IgG 孵育 1h；TBST 漂洗 30min；ECL显色. 同时以 actin蛋白为内参照.WesternBlot 结果用 Bandsc
7、an扫描软件进行灰度测定. 1.2.3 癌细胞条件培养液的收集以 2105/孔的密度将细胞种植于6 孔培养板中，用含 100mL/L 胎牛血清的 DMEM 培养基培养长至60%密度时，镜下观察见细胞贴壁良好，以无血清 DMEM 洗 3 遍，每孔再加入 DMEM(无血清，含有不同浓度 genistein)1mL，继续孵育 48h，收集培养上清液并活细胞计数，以 3000r/min，离心5min 去除细胞碎片，以细胞数为依据调整体积，分装后立刻进行酶谱分析或冻存于-80备用. 1.2.4 明胶酶谱活性分析将细胞条件培养液上样于 100g/LSDS4聚丙烯酰胺凝胶(胶中含 1g/L 的明胶，明胶是
8、IV 型胶原酶底物)，4条件下，浓缩胶 90V，分离胶 140V 恒压电泳，电泳后，将凝胶于含有 25mL/LTritonX-100 的洗脱液内振摇洗涤 3 次，每次30min.孵育液(50mmol/LTriscl，5mmol/LCaCl2 ，0.2g/LZnCl2 ，pH7.5) 内37孵育 18h；1g/L 考马斯亮蓝 R250 染色，300mL/L 甲醇、100mL/L 乙酸脱色，干燥保存.为了尽量避免误差，每组细胞均设3 个以上平行样本，并经多次重复实验. 1.2.5 计算机图像分析运用德国产 LEICAQ550IW 图像分析仪对明胶酶谱图像进行吸光度(A)测定，按照公式计算各条带的积
9、分 A 值.积分 A 值 =平均 A 值面积2 . 统计学处理：数据均以 xs 表示，SPSS10.0 软件对其进行 t 检验，P0.05 为差异具有统计学意义 . 2 结果 2.1genistein 对 MDAMB231细胞侵袭能力的影响侵袭实验结果显示，实验组与对照组细胞均能够侵袭至铺有 Matrigel 滤膜上（图 1）.24，48，72h3 个时间点上的侵袭细胞数，genistein15mol/L组为（24512）个， （30020）个，（37818）个；30mol/L 组为（15520 ）个， （20430）个，（25634）个.与 genistein0mol/L组相比较，genis
10、tein15mol/L和 30mol/L组侵袭细胞数均显著减少(P0.05)，且随着药物浓度的增加，侵袭细胞数逐渐减少，组间5差异具有 7 统计学意义 (P0.05，图 2). 2.2genistein 对 MDAMB231细胞基质金属蛋白酶MMP2， MMP9的表达影响在药物作用 48h 后，MDAMB231细胞基质金属蛋白酶蛋白表达，15mol/L，30mol/L 组 MMP2蛋白相对灰度值（相对于内参actin）分别为 0.320.06，0.120.03；MMP9 蛋白相对灰度值分别为 0.630.04，0.240.02.与 0mol/L相比较，基质金属蛋白酶蛋白 MMP2和 MMP9表
11、达逐渐减弱，差异具有统计学意义(P0.05，图 3). 2.3genistein 对 MDAMB231细胞分泌 MMP2，MMP9活性的影响酶谱分析结果显示，在 72103 和 92103 处有两条透明条带，分别代表活性形式的 MMP2和 MMP9.在药物作用48h 后，15mol/L 和 30mol/L组明胶酶的活性明显低于0mol/L组（ P0.05，图 4）. 在酶谱分析的酶缓冲液中，若加入基质金属蛋白酶的抑制剂 EDTA(终浓度 10mmol/L)，其他条件和过程不变，则无条带显出.实验重复 3 次，所得结果具有相同趋势 .3讨论 genistein 是目前唯一在大豆中含有的植物雌激素
12、，具有防癌、抗癌和抗纤维化作用的豆科植物3-4.豆类食物的高消费与包括乳腺癌在内的多种肿瘤发生风险呈明显负相关，而 genistein 可能是造成这种癌低发病率的重要原因5.但其具体机制尚不清楚 .研究6-7 表明， genistein 具有抑制卵巢癌细胞 SKOV3，胃癌细6胞 SGC7901等的体外侵袭能力 .我们的研究结果显示，genistein能显著抑制 MDAMB231细胞的体外侵袭能力，且呈现明显的剂量效应关系，进一步证实了 genistein 潜在的肿瘤侵袭转移抑制作用. 侵袭和转移是恶性肿瘤的一个重要特征，也是其致死的主要原因.影响侵袭转移的因素很多，而 MMPs 表达改变，尤
13、其是 MMP2和 MMP9表达升高，降解基底膜中的 型胶原能力增强是癌细胞侵袭与转移的关键步骤.已有研究8发现，乳腺癌组织 MMP2和 MMP9的表达均增加，引起肿瘤细胞降解 ECM 的能力增加，导致肿瘤转移.本研究采用不同浓度 genistein 处理乳腺癌MDAMB231细胞，检测 MMP2，MMP9 蛋白表达情况，结果表明，随着 genistein 作用浓度的增加， MMP2和 MMP9的蛋白表达降低.提示 genistein 能够在基因水平抑制MMP2， MMP9的翻译，降低细胞内基质金属蛋白酶的产生.同时本研究还采用酶谱法对肿瘤细胞分泌 MMP 活性进行检测，结果表明不同浓度 gen
14、istein 处理后，乳腺癌 MDAMB231细胞分泌MMP2， MMP9的活性显著降低 .综合以上结果可以看出：乳腺癌 MDAMB231细胞侵袭转移潜能与其产生 MMP 的能力密切相关，genistein 抑制了 MDAMB231细胞 MMP2，MMP9两种酶的表达，降低了其分泌活性，使得肿瘤细胞穿过人工基底膜的能力下降，进而抑制侵袭转移能力. 综上所述，genistein 是一种对肿瘤细胞侵袭转移影响较大的植7物提取药物，其在抑制细胞生长作用的同时，可通过抑制 MMP2和 MMP9表达和分泌活性，达到抑制乳腺癌细胞侵袭转移的目的. 【参考文献】 1DuffyC,PerezK,Partrid
15、geA.ImplicationsofphytoestrogenintakeforbreastcancerJ.CACancerJClin，2007,57(5):260-277. 2方征东, 李建生 ,徐修才.选择性环氧化酶 2抑制剂对肝癌细胞侵袭力的影响J.世界华人消化杂志，2006,14(3):293-298. 3HamalainenM,NieminenR,VuorelaP,etal.Antiinflammatoryeffectsofflavonoids:Genistein,kaempferol,quercetin,anddaidzeininhibitSTAT1andNFkappaBactivations,whereasflavone,isorhamnetin,naringenin,andpelargonidininhibitonlyNFkappaBactivationalongwiththeirinhibitoryeffectoniNOSexpressionandNOproductioninactivatedmacrophagesJ.MediatorsInflamm,2007,2007（1 ）：456-473. 4田爽，辛晓燕，黄艳红，等.Genistein 对人卵巢癌细胞系3AO 抑制增殖的作用及机制的探讨J.第四军医大学学报,2006,27(23):2120
