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1、1RBX 诱骨活性成分的分离与纯化作者：杨柳，胡蕴玉，吕荣，颉强 【关键词】 骨折愈合 关键词: 骨折愈合;蛋白质类/分离和提纯 摘 要:目的 重组合异种骨（RBX）作为一种新型植骨材料在临床治疗骨缺损、骨不连等病例中取得了显著疗效.需进一步研究重组合异种骨中诱骨活性蛋白的相对分子质量范围. 方法 采用肝素亲和层析技术纯化 RBX 中诱骨活性蛋白即骨形态发生蛋白（ BMP） ，利用小鼠肌袋实验检测其骨诱导活性，再用聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）测量 RBX 中诱骨活性蛋白纯化后的相对分子质量. 结果 在纯化近 20 倍后，获得 8.23mg 高度纯化的蛋白质，组织学观察其活性发现植入小鼠股
2、部第 10 日，有大量软骨细胞及软骨岛的出现，在局部区域还可见到条索状骨小梁出现，SDS-PAGE 电泳发现这种蛋白质的相对分子质量为 3510 3 ，经还原后单体的相对分子质量为 2210 3 . 结论 重组合异种骨（RBX）中 35103 的蛋白质经还原后为 22103 ，其单独使用具有异位成骨活性，为 RBX 的临床应用提供了理论依据. 2Keywords:fracture healing;proteins/isolation&purification Abstract:AIM As a new kind of bone graft material，re-constituted bon
3、e xenograft have gained much success in the repair of bone defect and bone nonunion.To study relative molecular mass of osteoinduction protein in reconstituted bone xenograft.METHODS Using heparin sepharose Cl-6B chromatography，the osteoinduction protein in reconstituted bone xenograft（bone morphoge
4、netic protein，BMP ）was pu-rified and fractions obtained from purification were bioassayed for bone-induction activity by implantation into the thigh muscles of mouse.Using sodium dodecyl sulfate-polyacry-lamide gel electrophoresis（SDS-PAGE） ，the molecular mass of purified protein could be known.RESU
5、LTS Osteoinduc-tion protein in RBX was purified for20fold and gained pro-tein8.23mg，and in vivo by the end of10th day，much more chondrocytes and cartilage matrix form and trabeculae can al-so been seen.From SDS-PAGE，highly purified protein is homodiner protein with relative molecular mass of35103 ，a
6、nd22103 on reduction.CONCLUSION The35103 protein in reconstituted 3bone xenograft was22103 on reduc-tion，and it had bone-inductive activity alone.The definition of osteoinduction protein in RBX can provide a theory founda-tion of clinical application of RBX. 0 引言 骨移植在治疗骨折不连接或延迟连接等多种原因造成的骨质缺损中应用广泛，但异
7、种骨移植的临床应用尚未完全解决.重组合异种骨（RBX）的发明为骨移植的临床应用开辟了新的领域，它是将具有诱骨活性的牛 BMP 与无抗原性的松质骨复合，临床修复骨缺损、骨不连取得了良好的效果.但 RBX 中具有诱骨活性的 BMP 是从牛骨中初步提取的，我们还不确切知道 RBX 中诱骨活性成份（BMP粗提物）的分子质量，及它与 RBX 活性的关系 .对其中起决定作用的诱骨成份尚不清楚.我们将天然提取的蛋白进一步分离、纯化与分析，探讨其中诱骨成份的作用机制，为重组合异种骨的临床应用提供可靠的理论依据. 1 材料和方法 1.1 重组合异种骨的制备 参考 Urist 等1 的报道，各个过程持续时间与试剂
8、用量因初始骨粒不同而做了调整.选取新鲜小牛四肢骨骨干制成骨粉，经4脱脂、脱钙及去除低分子量蛋白多糖等成份后，将其形成的骨基质明胶溶于提取液（6molL-1 脲/0.5molL-1 GaCl/1mmolL-1 NEMI）24h，提取上清，经透析、离心后得到粗制 BMP，将其复溶于纯化液（4molL-1 盐酸胍/0.5molL-1 GaCl/1mmolL-1 NEMI） ，上清再经透析、离心后得到了部分纯化的 BMP.在 0.08MPa 负压下将其与牛松质骨载体（本校西京医院自制）按 15 质量比复合，蒸馏水透析 72h，冻干. 1.2 肝素亲和层析纯化 取 160mg 部分纯化的蛋白复溶于 10
9、mL 的平衡缓冲液中（Buffer A:6molL-1 脲/50mmolL-1 Tris.HCl/0.1molL-1 NaCl pH7.0） ，以 20000g 的速度离心 30min，除去其中不溶的物质 .用上清对 160mm10mm 的肝素亲和层析柱加样（注意不要破坏凝胶表面）.层析柱分别按次序用以下三种缓冲液洗脱，即含有 0.1，0.15， 0.5molL-1 NaCl 的 Buffer A 溶液，分别收集洗脱下来的蛋白质，经透析、离心、冻干后保存，测质量. 1.3 生物活性检测 选用雄性 BALB/c 小鼠（第四军医大学实验动物中心供给）10 只，体质量（202 ）g，随机分成 2 组
10、，每组 5 只.将冻干后的5蛋白分别植入小鼠右侧股部肌袋中，其中 A 组植入 0.4mg 纯化后的蛋白质，B 组同时植入牛血清白蛋白作为对照.在术后第 10 日全部处死，取出植入物周围 2cm 的软组织.标本均经组织学常规处理，切片行 HE 染色，镜下观察异位成骨的情况. 1.4 蛋白相对分子质量的测定 采用十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，它多用于蛋白质及核酸的 Mr 测定.将纯化后的蛋白质溶于含有二硫苏糖醇（DTT）或不含有 DTT 的样品缓冲液中，90加热 35min，离心后用上清加样.电泳凝胶为 50mLL-1 的积层胶、125mLL-1 的分离胶.电泳完毕后，用考马斯亮蓝 R-2
11、50染色，再测其相对分子质量. 2 结果 将部分纯化的蛋白质加入层析柱后，洗脱液以120cmh-1 的速度洗脱（Fig1 所示）. 用 Buffer A 洗脱时，未吸附的蛋白质基本都流出;改用 Buffer B 液（含有0.15molL-1 NaCl） ，洗脱吸附较弱的蛋白，从 Fig1 可见此时 pH 值下降，离子浓度增加，且有较大量的杂蛋白流出，称为 B 峰;用含有 0.5molL-1 NaCl 的 Buffer C 液洗脱时，获得 C 峰，此峰为我们主要收集的目的蛋白.A 段蛋白与肝素亲和层6析无亲和力，故弃去不用，将 B 峰、C 峰收集的蛋白对四蒸水进行透析约 24h，其间换液 3 次
12、.透析发现，C 峰蛋白有白色絮状沉积，表明不溶于水;而 B 峰蛋白透析液仍澄清透明，均溶于水.将 C 份蛋白真空冻干后，测其质量为 8.23mg，纯化近 20 倍. 手术后的动物均未出现感染，生长良好.小白鼠于术后第 10日处死，切片经 HE 染色后观察发现，A 组所有标本切片上均可见到明显的软骨岛形成，软骨细胞大而圆，非常明显，在个别区域可看到条索状骨小梁的出现（Fig2） ，周围有少量淋巴细胞浸润;B 组无任何变化. 重组合异种骨自 1988 年发明以来，至今已用于千余例植骨术中，主要治疗骨不连、延迟连接和骨缺损等2 .随访发现，治愈率达 90%以上，引起国内外骨科专家关注.RBX 中诱骨
13、活性蛋白（即部分纯化的 BMP）来源于小牛四肢皮质骨，提取方法参考Urist 等1 的传统方法，经十余年的摸索、总结，建立了一套特有的工艺程序3 . RBX 的动物实验与临床应用都证实它具有较强的诱骨活性，但其中诱骨成份到底如何，目前尚不完全清楚;部分纯化的 BMP 活性往往优于高度纯化的 BMP4 ，其原因是否是由于纯化过程中丢失了某些具有较强活性作用的蛋白质，因而本实验试图探讨 RBX 中具7有较强活性的蛋白的相对分子质量范围.BMP 的纯化多采用离子交换层析、羟基磷灰石层析、葡聚糖系列凝胶层析及高压液相色谱等方法. 其中亲和层析由于具有操作方便、重复性高及纯化的蛋白纯度高、在透析后仍具有
14、较高的生物活性，得到许多学者的认同，在BMP 的纯化中取得了良好的结果 5，6 .本实验采用肝素亲和层析，依靠离子间作用力洗脱.实验操作分为 2 步，首先用含有 0.15molL-1 NaCl 的洗脱液洗脱，将一些与肝素非特异性结合的蛋白质先洗脱下来，再用高浓度液进行洗脱，将肝素高亲合的 BMP 洗脱下来，获得较高的纯度. 对 160 mg 的部分纯化 BMP 进行纯化，获得与肝素具有高亲和力的蛋白 8.23mg，它在水中呈白色絮状沉淀，溶解度较低.体内实验中，将 0.4mg 纯化后的蛋白质植入小鼠股部肌肉内后，第 10 日发现有大量软骨细胞、软骨岛形成，软骨细胞大而圆，非常明显，并可见有条索
15、状骨小梁形成，此高度纯化的蛋白质可以诱导未分化的间充质细胞分化为软骨与骨，是具有异位成骨的能力. 在 SDS-PAGE 电泳中（Fig4） ，纯化后的蛋白 Mr 为35103 ，如在样品缓冲液中加入二硫苏糖醇（DTT） ，经还原处理后，Mr 为 22103 .DTT 作为一种变性剂，较十二烷基硫酸钠（SDS ）作用更强烈，它可将蛋白质各链间的二硫键断开，这样具有空间结构的蛋白质就变成线状的蛋白链.所以这种经高度纯化、具有较好活性的蛋白质在体内是由同源二聚体构成的，单体 Mr 为822103 ，与文献报道一致:Luyten FP6 采用肝素亲和色谱、羟基磷灰石等层析后发现，其活性蛋白 Mr 为（
16、3040）103 之间，经还原后 Mr 为 22103 .Sampath TK 5 等也得到相似的结论，他们称此为成骨素（osteogenin）. 经氨基酸序列分析发现与 BMP -3 有较高的同源性，但它不象重组 BMP-3 在体内只能诱导软骨形成，它还可诱导成骨. 另外，Wang 等7 及 Urist 等8 都提出牛 BMP 的Mr 为（ 18.00.5）10 3 .他们在提取过程中主要采用 Sephacryl 或 Sepharose 系列层析柱及离子交换层析柱或羟基磷灰石柱等，得到了 30103 的蛋白，还原后为 30103 ，18103 ，16103 ，其中认为 18103 的蛋白为真正的 BMP，而 30103 ，16103 的蛋白对于 18103 的 BMP 活性是不可缺少的.1990 年有学者 Sampath TK 9 对BMP 活性部分继续研究，碳端氨基酸序列分析 18
