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1、1CD59 特异位点短肽封条对 T 细胞封闭作用【摘要】目的探讨含有 CD59 特异位点的短肽封条对 T 细胞的封闭作用及其可能机制。方法建立 HeLa 肿瘤小鼠模型，眼球取血分离血清测定补体 C3、C4，分离培养鼠胸腺 T 淋巴细胞、分别加入CD59mAb、CD59 特异位点短肽封条作用 48h 后,MTT 法检测 T细胞增殖情况。结果肿瘤小鼠补体 C3、C4 含量明显降低（t=30.970 、16.789,P0.01 ） ；CD59mAb 对 T 细胞增殖起促进作用，而含有 CD59 特异位点的短肽封条能抑制 T 细胞增殖，两者的作用与正常对照相比差异有显著性（t=5.428、4.726，
2、 P0.01） 。结论 CD59 参与 T 细胞信号转导而与补体抑制作用无关，含有 CD59 特异位点的短肽封条对 T 细胞起封闭作用。 【关键词】抗原,CD59；短肽封条；肿瘤；T 淋巴细胞；细胞增殖 CD59 是小分子的高度糖基化的 GPI 锚固蛋白, 广泛分布于造血细胞、非造血细胞及多种组织细胞表面，其主要功能是调节补体活化，通过与补体攻膜复合物（MAC）装配过程中的 C8 和（或）C9 结合从而抑制补体的活化1。除了已被广泛认知的调节补体作用外，还具有细胞信号传导的功能2。有研究显示，肿瘤病人机体处于免疫失平衡状态，且这种失平衡与 T 细胞信号传导缺陷相关3。在肿瘤病人机体中，T 细胞
3、表达的 CD59 在细胞信号传导过程中发挥何种2作用及对 T 细胞活性产生何种影响，在国内外文献中尚未见报道。本文通过建立小鼠肿瘤模型，研究荷瘤机体中 CD59 对 T 细胞活性的影响，并将本室研制的利用噬菌体肽库筛选技术体外合成的针对CD59 活性位点的短肽封条(sp)4应用于 T 细胞，观察其对 T 细胞的封闭作用并探讨其可能机制。 1 材料与方法 1.1 试剂 HeLa 细胞由本室保存，含有 CD59 特异位点的短肽封条系本室自制。RPMI1640 培养液(Gibco 公司)，标准胎牛血清（FCS） ，淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限公司） ，MTT(中国医学科学院血液研究所)
4、，Hepes(Solarbio 公司)，ConA（Sigma公司） 。 1.2 动物选择与分组 取 BALB/C 纯系小鼠 32 只,雌雄各半,3 4 周龄，体质量1822g。随机分为 2 组：组每只小鼠腋窝皮下注射生理盐水0.2mL；组每只小鼠腋窝皮下注射 108/L 的 HeLa 细胞 0.2mL。每天观察记录，于第 20 天处死小鼠5。 1.3 细胞制备 无菌分离组、组小鼠胸腺，制备单细胞悬液，淋巴细胞3分层液分离获取单个核细胞，再经尼龙毛柱处理获取 T 淋巴细胞，锥虫蓝染色细胞活率 95%以上。调整细胞浓度为 4108/L，加入含体积分数 0.10 的 FCS、青链霉素双抗的 RPMI
5、1640 培养液10mL，放入 37含体积分数 0.05 的 CO2 温箱中培养。 1.4 补体 C3、C4 的测定 自小鼠心脏取血，置 37水浴 30min，然后以 2000r/min离心 10min，在美国德灵公司 BNP 全自动特种蛋白分析仪上检测。1.5 四甲基偶氮唑盐 (MTT)微量酶反应比色法检测淋巴细胞的增殖情况 1.5.1 不同浓度 CD59mAb、sp 对小鼠 T 细胞增殖影响设定空白对照组、ConA 对照组、ConA+CD59mAb（1 、2、4mg/L）组、ConA+ 含有 CD59 特异位点的 sp（12.5、25.0、50.0mg/L）组，每组各设 3 个复孔。取前期
6、准备的正常小鼠 T 淋巴细胞，调整细胞浓度为 4108/L，加入 96 孔板中，每孔为 100L，按上述分组加入相应试剂,每孔50L。放入 37含体积分数 0.05 的 CO2 温箱中孵育 48h，然后每孔加入 MTT10L，振荡混匀，放入 37含体积分数 0.05 的CO2 温箱中孵育 4h。而后加入 100g/LSDS0.02mol/LHCl,每孔100L，充分吹打混匀 20min 至完全溶解。全自动酶标检测仪测570nm 波长处吸光度（A）值。1.5.2CD59mAb 、sp 对不同实验4组小鼠 T 细胞增殖的影响调整组、组的 T 淋巴细胞浓度为4108/L，加入 96 孔板中，每孔 1
7、00L。设定空白对照组、 ConA对照组、ConA+CD59mAb （2mg/L）组、 ConA+含有 CD59 特异位点的 sp（25mg/L）组，每组各设 8 个复孔，每孔加试剂50L。放入含体积分数 0.05CO2 的 37 温箱中孵育 48h。加MTT，每孔 10L，振荡混匀，放入含体积分数 0.05CO2 的 37温箱中孵育 4h。加入 100g/LSDS0.02mol/LHCl，每孔为100L，充分吹打混匀 20min 至完全溶解。酶标检测仪测 570nm波长处 A 值。以各样本测定孔 A(AS)值减对照孔 A(AC)值,求得 A 差值（A）, 分别计算增殖率、抑制增殖率：增殖率=
8、A/AC100%；抑制增殖率=|A|/AC100%。重复 3 次取平均值。1.6 统计学处理 采用 SPSS10.0 和 PPMS1.56软件进行统计处理，数据均以s 表示，两样本比较采用 t 检验。 2 结果 2.1 小鼠瘤质量及成瘤率 小鼠的成瘤率为 66.7%,瘤体直径为（ 4.310.10）mm, 瘤质量为(1.0890.056)g。 2.2 补体 C3、C4 含量测定 5组小鼠的补体 C3、C4 的含量分别为（0.9510.020） 、（0.4010.027）g/L，组小鼠则分别为（0.4650.032） 、（0.1520.024）g/L，组较组明显降低(n=6，t=30.970、1
9、6.789,P0.01)。 2.3MTT 法检测 T 细胞体外增殖情况 2.3.1CD59mAb、sp 对正常组 T 细胞体外增殖的影响经48h 培养后显示，CD59mAb 对 T 细胞增殖有明显促进效应，且随着浓度的升高，T 细胞增殖明显（图 1） 。相反，含有 CD59 特异位点的 sp 对 T 细胞的增殖有明显抑制效应，随着浓度的升高，T 细胞增殖明显被抑制（图 2） 。 图 1CD59mAb 对正常组 T 细胞体外增殖的影响（n=3）（略） 图 2sp 对正常组 T 细胞体外增殖的影响（n=3 ） （略） 2.3.2CD59mAb、sp 对不同实验组小鼠 T 细胞的增殖作用经 48h 培养后显示， CD59mAb 对组小鼠 T 细胞的增殖效应要明显强于其对组小鼠的作用，其增殖率分别为(80.222.34)%、(71.181.56)%，组间比较差异有统计学意义（t=5.428,P0.01） 。而 sp 对 T 细胞的增殖表现为抑制效应，两组抑制增殖率分别为(17.681.03)%、(14.820.70)%,组间比较差异有显著意义（t=4.726,P0.01） 。
