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1、1CD59 基因突变在肿瘤逃逸中的作用【摘要】 目的 构建 CD59 突变的重组体，研究 Hela 细胞中CD59 基因突变引起肿瘤凋亡相关分子 caspase3 表达的变化。方法 采用重组聚合酶链反应定点诱变技术，将 CD59 的第 3941 位氨基酸突变为色氨酸，克隆入 pALTERMAX 质粒，采用阳离子脂质体法将重组质粒转染 Hela 细胞。G418 筛选稳定表达细胞克隆，用免疫荧光、ELISA、流式细胞术筛选出高表达突变 CD59 的细胞株，用免疫组化法检测转染前后 Hela 细胞内 caspase3 表达的变化。结果 酶切鉴定和序列测定均证实成功构建了 CD59 氨基酸突变的重组质
2、粒。转染突变 CD59 后 Hela 细胞内 caspase3 表达明显减少，与转染正常 CD59 的 Hela 细胞比较差异有显著意义（t=2.846,P0.01)。结论 caspase3 表达变化可能是 CD59 引起肿瘤逃逸的另一途径。 【关键词】 抗原 CD59 点突变 肿瘤逃逸 基因重组 Hela 细胞 Caspase 3 ABSTRACT Objective To construct mutant CD59 molecular, and study the alleosis in the expression of caspase3 correlative with tumor a
3、poptosis brought about by CD59 mutation in Hela cells. Methods Using polymerase chain reaction sitedirected mutagenesis, the amino acid of the 39th and the 41th mutated to tryptophanes. Mutant 2CD59 DNA inserted into the vector pALTERMAX and transfected into the Hela cells via lipofectamine method.
4、Stable expression clones were selected by the addition of G418. The G418resistant clones which expressed relatively high levels of mutant CD59 were sorted by immunofluorescence method, ELISA and flow cytometry. The expression of caspase3 in Hela cells before and after transfection was tested immunoh
5、istochemically. Results Recombinant plasmids of pALTERMAXCD59 had been successfully constructed according to sequence of enzyme digestion analysis and fragment investigation. The amount of caspase3 in Hela cells which were transfected was obviously lower than that in Hela cells which were transfecte
6、d with nomal CD59, and the difference was obvious (t=2.846,P0.01). Conclusion Another way by which CD59 leads the tumor escaping may be the expression changing of caspase3. KEY WORDS Antigens, CD59; Point mutation; Tumor escaping; Mutagenesis; Hela cells; Caspase3 众所周知，肿瘤的免疫逃逸是导致治疗方案失败的重要原因31。至今为止，国
7、内外学者对肿瘤逃逸的机制已有多方面的阐述。近年来，国外学者在肠道、卵巢及前列腺等多种实体肿瘤细胞中发现有 CD59 分子的高表达。CD59 是一种补体调节蛋白,其以糖基磷脂酰肌醇（GPI ）锚着于多种细胞膜表面 4，通过阻止补体攻膜复合物(MAC)的装配保护宿主细胞免受补体介导的溶细胞作用5,6。近年来的研究显示，CD59 与肿瘤的生长失控和转移密切相关2,3，但有关其与肿瘤逃逸的相关性研究目前尚未有定论。本文通过研究caspase3 的表达变化，探讨 CD59 与肿瘤逃逸的相关活性位点，为肿瘤的靶向治疗提供新的思路。 1 材料和方法 1.1 材料 pALTERMAX、pALTERCD59 由
8、美国哈佛大学惠赠, EcoR 酶、DNA 聚合酶、T4 连接酶均购自大连 TaKaRa 公司，细菌菌株 E.coli.JM109 为本室保存，小牛血清为天津灏洋生物制品科技责任有限公司产品，Trypsin（1250）购自 SinoAmerican Biotec 公司，RPMI 1640 培养基、G418 选择抗生素、LipofectamineTM2000 均为 Invitrogen 公司产品，鼠抗人 CD59单抗为本实验室制备，羊抗鼠 IgG2aFITC、羊抗人 CD59 单抗和HRP 标记兔抗山羊 IgG（H+L）均购自北京中山生物技术有限公司，荧光抗体 CD59FITC 购自 COULTE
9、R 公司，caspase3 免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，Hela 细胞由本实验室保4存。设计两对寡核苷酸引物，通用引物：pT7，T3；突变引物：M/F，M/R 。以上引物均购自上海生物工程有限公司。 1.2 方法 1.2.1 重组真核表达载体的构建 在原构建的重组质粒pALTERCD59 的基础上, 设计两对反向互补、含有突变位点的引物及一对通用引物，由生物公司合成。其序列如下。通用引物pT7： 5TAATACGACTCACTATAGGC3；通用引物T3：5TATTCAGGCGTAGCAACCAG3 ；突变引物M/F：5GTGTATAACAAGTGGTGGTGGTTTGAGC
10、ATTGC3； 突变引物M/R：5ATGCTCAAACCACCACCACTTGTTATACACTTG3 。 以已构建的 CD59 cDNA 重组质粒为模板，以常规引物 pT7 和诱变引物 M/R 进行 PCR1 反应，以已构建 CD59 cDNA 重组质粒为模板，以常规引物 T3 和诱变引物 M/F 行 PCR2 反应，将纯化 PCR1和 PCR2 产物等量混合为模板，以通用引物 pT7 和 T3 行 PCR 扩增反应，从而得到所需的诱变位点的大量 DNA 片段，该突变可使CD59 第 3941 位氨基酸均突变为色氨酸。经琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物，并回收目的条带。将质粒 pALTER
11、及含有全长突变CD59 基因的 PCR 产物用 EcoR 单酶切后，经 T4 DNA 连接酶作用，使突变基因插入到 pALTER 质粒的 EcoR 位点, 以构建重组真核表达质粒。用 TSS 法使重组质粒转化感受态的细菌 JM109，经氨苄青霉素筛选后，挑取单个菌落用酚抽提法提取质粒，以 EcoR 5酶切鉴定。对筛选的克隆进行序列测定，由上海生物工程有限公司完成。 1.2.2 Hela 细胞的转染及阳性克隆的筛选 重组质粒的转染参照 LipofectamineTM2000 的说明书进行。转染后 24 h，将细胞按 110 稀释传代，24 h 后加入含有 800 g/L G418 的选择性培养基
12、，筛选 2 周后套取单克隆并继续筛选 2 周，扩大培养始终维持G418 在 400 g/L。连续传代 10 次后，收集细胞进行鉴定。 1.2.3 Hela 细胞中突变 CD59 的检测 免疫荧光技术: 刮取细胞, 离心去上清, 用 PBS 洗 3 次。涂片、干燥后, 用乙醇固定后晾干, 加入鼠抗人 CD59 单克隆抗体，37 孵育 30 min, 洗涤后加入羊抗鼠的 FITCIgG 二抗，于 37 孵育 30 min，洗涤，干燥后在荧光显微镜下观察结果。ELISA 法：收获并裂解细胞 ,测定并调节标本和对照蛋白质质量浓度为 5 mg/L,用包被液以11、12、14 稀释待测标本和空白 PALT
13、ER 对照,并分别设 6个复孔,每孔加入 100 L 样品,4 包被 18 h,封闭,加入鼠抗人CD59 抗体后 ,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG,然后加底物显色液（邻苯二胺）显色,测定 495 nm 处吸光度（A ）值。流式细胞术：刮取转染突变 CD59 的细胞株(5108/L)，加入 FITC抗人CD59 单克隆抗体，设置野生 Hela 细胞为对照，实验组及对照组均设定 FITCIgG 二抗，同型对照，上机检测。 1.2.4 肿瘤逃逸相关分子 caspase3 的检测 用免疫组织化学法检测转染突变 CD59 后 Hela 细胞内 caspase3 表达的变化，6操作按照 caspa
14、se3 免疫组化试剂盒使用说明书进行。用Imageproplus 5.0 软件对所得图片进行吸光度测量。 1.3 统计学处理 数据间比较采用 t 检验。 2 结果 2.1 重组质粒的鉴定 以 EcoR 酶对重组质粒进行酶切,获得 1 条 496 bp 的电泳带, 与所插入的片段的大小相一致( 图 1)。测序结果表明,突变CD59pALTER 含有突变 CD59 的全长 cDNA 序列。见表 1。 2.2 荧光免疫组化检测 荧光显微镜下可见转染突变 CD59 的 Hela 细胞表面的荧光亮度明显强于未转染突变 CD59 的 Hela 细胞。 2.3 ELISA 检测 转染突变 CD59 的 He
15、la 细胞裂解产物的 CD59 蛋白表达量明显高于 Hela 对照组，差异有显著性（t=3.1954.842,P0.01） 。见表 2。 2.4 流式细胞术检测 7转染突变 CD59 的 Hela 细胞的 CD59 表达率为78.32%（图 2） 。 2.5 转染前后 Hela 细胞内 caspase3 的表达变化 转染突变 CD59 后 Hela 细胞的平均吸光度值为 0.1890.029，转染正常 CD59 的 Hela 细胞的平均吸光度值为 0.2020.031,两者比较，差异有显著性（t=2.846,P0.01） 。 3 讨论 CD59 是一种 GPI 蛋白，可以作用于补体激活终末阶段
16、的MAC 的形成，使肿瘤细胞免受补体介导的溶细胞作用从而引起肿瘤逃逸。目前已有研究显示,CD59 分子中 N37H44 位基因突变可导致糖尿病的发生,其 NMR 结构显示抗补体活性区域也主要集中于N37 H44 之间7。肿瘤逃逸相关活性位点虽然尚未有明确定位,但无疑为寻找该活性位点提供了理论性的指导，从而引导我们发现肿瘤逃逸中可能存在的其他途径。 表 1 突变人 CD59 与野生型人 CD59 的差别（略） 表 2 ELISA 实验结果（略） 与野生 Hela 细胞比较，*t=3.1954.842,P0.01 图 1 重组质粒鉴定结果 DNA Marker; 酶切的重组突变 CD59 质粒;未经酶切的8突变 CD59 重组质粒 AB 图 2 流式细胞术检测结果（略） 对于类似 p53 编码基因等
