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1、1BALL 患者胸腺输出 TCR V 亚家族 nave T 细胞分析【摘要 】 目的 了解 B 细胞 急性淋巴细胞白血病（ BALL）患者外周血 T 细胞中 TCR V亚家族 23 种信号 T 细胞受体删除 DNA环（sjTRECs）的存在情况，从而了解胸腺近期输出各 TCR V亚家族 nave T 细胞的功能。方法 利用半巢式 PCR 分别扩增 10 例BALL患者外周血单个核细胞 DNA 中的 23 种 VD1 sjTRECs，10 例正常人作为对照。结果 TCR V亚家族 sjTRECs 在大部分正常人和部分 BALL患者中均可检测到，与正常人比较，BALL病人的 V24D1 sjTRE
2、Cs 出现频率比正常人高，且有统计学意义（80%30%, P=0.0285） ，另有 18 个家族的 VD1 sjTRECs 比正常人低，其中在 V1（30%, P=0.0285） 、V12（20%,P=0.0285 ） 、V13（40%, P=0.0043） 、V15 （20%, P=0.0022）和 V18（20%, P=0.0089）5 个亚家族 sjTRECs 出现频率的差异有统计学意义。结论 BALL病人胸腺输出大多数 V亚家族 nave T 细胞功能低于正常人。 【关键词】 急性淋巴细胞白血病 T 细胞受体删除 DNA 环 胸腺近期输出功能20 引言白血病患者常伴有细胞免疫功能缺陷
3、，既往的研究多数仅了解病人的外周血中所表现的细胞免疫状态，而未能更好地了解其胸腺功能情况。自从 1998 年 Douek 等首次报道通过定量检测外周血中 T细胞受体删除 DNA 环（Tcell receptor excision DNA circles, TRECs 或称 sjTRECs）从而检测胸腺近期的输出功能后，sjTRECs被用来作为测量近期胸腺输出的敏感指标，应用于多种免疫缺陷性疾病等的检测13 。我们的前期研究报道了正常人和白血病患者外周血中 sjTRECs 的定量检测情况 4,5。对 RecJ sjTRECs 分析仅代表了总的胸腺近期输出功能，而不能具体到各亚家族的sjTRECs
4、 的情况。本研究在建立了对 TCR V亚家族 sjTRECs 检测的基础上，分析 B 细胞-急性淋巴细胞白血病（BALL ）患者 V亚家族 nave T 细胞的近期胸腺输出情况。1 资料与方法1.1 资料经细胞形态学和细胞组化，按 FAB 分型确诊的表 1 用于 PCR和半巢式 PCR 的引物序列及半巢式 PCR 产物3引物序列作用半巢式 PCR 产物（bp ） V1Y15ccggagtgaggagggacagtgcagaggtg 3 下游引物 556bp V2Y15gcacacacactcccagatgtctcagtcaggaaagc 3下游引物400bpV3Y15catcggagccagc
5、accagccctgagttag 3下游引物 345bpV4Y15atacccatgcccacccacaaacacagaaacag 3下游引物 419bpV5Y15ttttccccagccctgagttgcagaaagcccc 3下游引物 431bpV6Y15gccacgattgcttccaccacccacatttacag 3下游引物 472bpV7Y1 5ggcagagtcacactcaggcaaaaggaaaccc 3 下游引物 469bpV8Y1 5gcagcccttctcaagagcccccaccattc 3下游引物596bpV9Y15gtgccacacagaaagaaaagaaaga
6、gcttccc 3下游引物 592bpV10Y15cgtagtgcctaccaacctgctacacacttatttcc 3下游引物 339bpV11Y15ggcaagatgtcctcacattagaggcgaccctttc 3下游引物321bpV12Y15agttggtctgagactggggtaggaatggacg 3下游引物 452bpV13Y15gcaacaaaggagacatctgaggacctgggacc 3下游引物490bpV14Y15cagtgagcttgtcctgcccaactttgaaacc 3下游引物 499bpV15Y15ctaaacaccccacatcccacaacc
7、cacatcc 3下游引物 362bpV16Y1 5cctcacagtcagagtcacaaacctttcagagcag 3下游引物585bpV17Y15cgtttcctgccatcatagagtgcagaggagccctgt 34下游引物 357bpV18Y15tcctacaatcctcccctatttccaccctcaac 3下游引物 416bpV19Y15ctcccttccagcctaatacatcacctgcttcc 3下游引物343bpV21Y15tgagcccagatcgcaccactgcactccagcc 3下游引物 510bpV22Y15agctgcaagaacaaacccaa
8、ccagagacttcc 3下游引物 379bpV23Y1 5gcagcccccacctccttctccctattacatcc 3下游引物342bpV24Y15gtctacagatattgacagccaccaacccacttcc 3下游引物 391bpD1Y25gtcatagcttaaaaccctccgagtgacgcacagcc 3首次 PCR 上游引物 D1Y35agaccagccccttcgccaaacagccttac 3半巢式 PCR 上游引物初发未治 BALL患者 10 例（男 8 例，女 2 例） ，年龄 377岁，中位年龄 33 岁。10 例正常人外周血作为对照，年龄 2543岁
9、。分离外周血单个核细胞，提取 DNA，均按常规方法进行。1.2 引物设计根据基因库所提供的 TCR基因组全长核苷酸序列（ACCESSION：U66059，U66060，U66061）设计引物。于各TCRV基因位点下游的非编码区设计 1 个下游引物（Y1 ）和 D15基因片段上游非编码区设 2 个上游引物（外侧引物 Y2，内侧引物Y3）68 ，引物的方向恰好与一般的 PCR 引物相反，只有当所在的 V基因片段与 D1基因片段发生重排，所删除的非编码区片段形成一环形 DNA 时，才能扩增到 PCR 产物。由于 V20亚家族基因重排时不形成 sjTRECs，故本试验不检测该亚家族。本研究所采用的引物
10、，见表 1。1.3 半巢式 PCR首次 PCR 分别应用下游引物 Y1 和外侧引物 Y2 进行各VD1 sjTRECs 的 PCR 扩增；然后以首次 PCR 产物（2 l）为模板，分别利用下游引物 Y1 和相应的上游内侧引物 Y3 进行半巢式PCR 扩增。总反应体积为 20 l，首次及半巢式 PCR 模板量均为 2 l、10 mol/L引物、1 mmol/L dNTP、2 u Taq 聚合酶（Promega） 、10Buffer 缓冲液和 1.5 mmol/L MgCl2。反应在PCR 扩增仪（BioMetra ）中进行。在 94、3 min 预变性后，首次及半巢式 PCR 均进行 30 个循
11、环，每一循环包括：94 1 min，65（第二次 PCR 为 70）1.5 min 和 72 1.5 min（末次 6 min） ，PCR 产物保存于 4 中备用。PCR 产物在 1.5%琼脂糖凝胶（溴乙锭染色）中电泳分析结果7。1.4 统计学处理6两组样本中 23 个 TCR V亚家族 sjTRECs 检测情况用检出率来表示，显著性检验用四格表的 Fisher 确切概率法检验。2 结果各亚家族 TCR VD1 sjTRECs 在大部分正常人及部分BALL患者外周血 T 细胞 DNA 中均可检测到，见图 1，两组检出率结果见图 2。10 例正常人的 VD1 sjTRECs 检出率多数较高，其中
12、 V10、V13 和 V14的 sjTRECs 检出率为100%，V3、V5、V15 和 V22的 sjTRECs 检出率为 90%。而10 例患者的 VD1sjTRECs 中 23 个亚家族中有 13 个亚家族低于 50%，V24 亚家族检出率最高为 80%。与正常人比较显示：10例患者中 1 个家族（V24）sjTRECs 出现频率比正常人高且有统计学意义（P=0.0285） ，1 个家族（V11 ） sjTRECs 出现频率比正常人高但无统计学意义（P=0.6477） ，3 个家族（ V2、V6 、V19）sjTRECs 出现频率与正常人相同，其余 18 个家族比正常人低，其中在 V1（
13、30%, P=0.0285） 、V12（20%, P=0.0285） 、V13（40%, P=0.0043） 、V15（20%, P=0.0022）和V18（20%, P=0.0089）5 个亚家族 sjTRECs 出现频率的差异有统计学意义。3 讨论7BALL为造血系统常见的恶性肿瘤，由于 B 细胞恶性克隆性增生，不仅出现机体体液免疫功能异常，也常常累及细胞免疫功能9。近期有研究报道儿童 B 淋巴细胞肿瘤胸腺近期输出功能的情况，本研究则进一步分析其各 V亚家族胸腺输出功能的特点。分析 TCRVD1 sjTRECs 的原理是基于 T 细胞在胸腺中发育成熟过程中，T 细胞受体 V基因所形成的 T
14、 细胞受体删除 DNA 环（TRECs）或信号结合 T 细胞受体删除环（sjTRECs） 。sjTREC 为游离基因，并不随着 T 细胞的进一步分裂而扩增，外周血中的 sjTREC的含量代表了 TCR 基因初始重排形成有功能 TCR 时的 nave T 细胞的含量，分析各 V亚家族重排时所形成的 sjTREC 则可以了解各亚家族 nave T 细胞的存在情况，即可代表胸腺近期的输出功能。我们前期的研究已经建立了 TCR DJ 和部分 VD1 sjTRECs的分析方法7,8，同时也报道了多种白血病中胸腺近期输出功能低下的情况4,5。本研究采用半巢式 PCR 方法扩增了 10 例 BALL患者外周
15、血单个核细胞 TCR V谱系基因重排时形成的 23 种 VD1 sjTRECs。初步结果提示 BALL胸腺近期 V各个亚家族 nave T细胞可以从外周血中检测到。在 TCR V谱系 23 个亚家族中有 18个亚家族 sjTRECs 正常人检出率高于患者，且其中 5 个8（V1 、V12 、V13、V15 、V18）亚家族有统计学意义。研究的结果提示 BALL病人胸腺近期输出各 V亚家族 nave T 细胞绝大多数低于正常情况，进一步说明胸腺近期输出各 V亚家族的nave T 细胞也存在不平衡的情况，这与检测患者总的胸腺输出功能以及检测各 V亚家族基因谱系的情况相吻合9,10。本研究成功检测并率先提供了 BALL患者外周血单个核细胞中 V 23 个亚家族 sjTRECs 的存在情况，从而为初步了解 BALL患者 V谱系nave T 细胞的输出情况提供了新的资料，接下来还需要进一步进行定量 PCR 检测，以更确切了解胸腺近期 naveT细胞的输出情况。【参考文献】 1 Douek DC，McFarland RD，Keiser PH，et alChanges in
