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1、1Bit1 基因在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测作者：滑玮，张伟，吕海鹏，辛晓燕【关键词】 凋亡；Bit1 基因；酵母菌双杂交；报告基因Expression of Bit1 gene in a yeast twohybrid system and reporter gene activation assay【Abstract】 AIM: To construct a bait vector with Bit1 gene in yeast twohybrid system GAL4, and assay whether Bit1 gene expression product
2、affects the growth of host yeast cells and activates the reporter genes in the yeast twohybrid system. METHODS: The Bit1 gene fragments were amplified by RTPCR from ovarian cell Caov3, and cloned into pUC19 for DNA sequencing. After verified by DNA sequencing, they were subcloned into the bait vecto
3、r pGBKT7 of yeast twohybrid system GAL4, and the recombinant plasmids were subsequently transferred into yeast cell AH109, and its expression product was tested whether it could activate the reporter genes in the yeast twohybrid system. RESULTS: The 2Bit1 gene fragments were successfully amplified,
4、and their expression product showed to be nontoxic to AH109 cells, and did not activate the reporter genes of the GAL4 system. CONCLUSION: Yeast twohybrid GAL4 system can be utilized to study Bit1interacting protein.【Keywords】 apoptosis; Bit1; yeast twohybrid system; reporter genes【摘要】 目的：用 Bit1 基因片
5、段构建酵母双杂交诱饵载体，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法：运用 RTPCR 技术从卵巢癌细胞系 Caov3 中扩增出Bit1 基因片段，克隆入 pUC19 质粒，经测序正确后，再克隆入酵母双杂交诱饵载体 pGBKT7 中，将重组质粒导入酵母菌 AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果: 成功获得 Bit1 基因片段，Bit1 基因表达的蛋白对酵母菌 AH109 无毒性，对报告基因亦无激活作用. 结论：可以利用酵母双杂交 Gal4 系统来研究与 Bit1 相互作用的蛋白.【关键词】 凋亡；Bit1 基因；酵母菌双杂交；报告基因【
6、中图号】 R73730 引言酵母双杂交系统是一种直接在真核细胞内检测蛋白相互作用的方法，具有灵敏度高和特异性好的优点.自 1989 年由 Fields 等1提出并初步建立以来，得到了不断的完善和改进，在细胞生物学，肿瘤学，蛋白质组学等诸多领域有着广泛的应用2-3. Jan等4在研究 bcl2 转录调控的实验中，发现了一种可下调 bcl2 表达的新基因，并因其功能而命名为 Bit1（bcl2 inhibitor of transcription 1）. 研究表明，胞浆内 Bit1 浓度的升高可以明显促进凋亡的发生，而其浓度的降低可以减少凋亡的发生.我们拟利用酵母双杂交 GAL4 系统，构建 Bi
7、t1 蛋白即诱饵蛋白，以期从人脑 cDNA文库中钓取可与之结合的蛋白基因，为研究细胞凋亡的发生和调节提供新的思路和实验依据.1 材料和方法1.1 材料卵巢癌细胞系 Caov3 购自中国医科大学细胞生物研究所，表达载体 pGBKT7 及酵母菌种 AH109 购自 Clontech 公司.质粒 pUC19 由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室张伟博士惠赠. 逆转录酶购自 Promega 公司；PCR 试剂盒，DNA 重组所用的限制性内切酶购自 Takara 公司；T4 DNA 连接酶购自 Gibco4公司；质粒提取试剂盒，DNA 电泳胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司；酵母培养基购自 Clo
8、ntech 公司.1.2 方法1.2.1RTPCR 扩增 Bit1 基因自行设计出克隆 Bit1 基因的引物.常规培养 Caov3 细胞，提取细胞总 RNA, 加入下游引物和逆转录酶，45各作用 30 min 进行逆转录,反应条件为：70 10 min, 42 45 min, 95 5 min. 再取逆转录产物加入引物 P1 和 P2 扩增 Bit1基因.PCR 反应条件为：94 30 s, 61 45 s，72 50 s，共进行38 个循环.1.2.2RTPCR 产物克隆及鉴定纯化的 RTPCR 产物经 EcoR和 BamH双酶切，定向克隆入 pUC19 质粒，转化大肠杆菌DH5，进行蓝白筛
9、选.酶切鉴定出含插入片段的阳性克隆，命名为pUC19Bit1 ，然后进行序列分析 .1.2.3 构建及鉴定诱饵载体用 EcoR和 BamH酶切pUC19Bit1 和表达载体 pGBKT7，回收 Bit1 基因及 pGBKT7 载体片段，载体片段与 Bit1 基因连接后转化大肠杆菌 DH5.经限制性内切酶分析,含正确插入片段的克隆命名为 pGBKT7Bit1.51.2.4 制备酵母感受态细胞随机挑取几个酵母菌 AH109 克隆，接种于 50 mL YPDA 液体培养基中，振荡培养至 A600=0.40.5.在室温下将培养液离心，弃上清，重悬沉淀，洗涤酵母细胞.再离心取沉淀，用 1.5 mL 1T
10、E/LiAc 溶液重悬，即为酵母感受态细胞.1.2.5 转化酵母感受态细胞将构建好的诱饵载体，鲱鱼精DNA 和酵母感受态细胞，混匀后加入 0.6 mL PEG/LiAc 溶液.在30振荡培养, 加入 DMSO 后混匀, 在 42水浴 15 min, 冰浴 2 min,离心, 去上清，以 0.5 mL 1TE 重悬细胞后，铺于 SD/Trp 平板. 于 30培养 36 h 左右，直至带有诱饵载体的酵母克隆长出 .1.2.6HIS3 和 LacZ 报告基因表达的检测用无菌牙签随机挑取酵母菌单个克隆，分别划线于有 Trp，Ura，His，Leu 营养缺陷的SD 平板上，于 30培养 36 h，观察酵
11、母菌的生长情况. 采用 半乳糖苷酶印膜法检测 lacZ 报告基因的表达 .用无菌牙签随机挑取酵母单个克隆，点样于硝酸纤维素滤膜上.将带有酵母克隆的滤膜在液氮中迅速冷冻 5 s 后，置于室温裂菌. 将点有菌体的滤膜面朝上，放在另一张同样大小浸有 Z buffer/Xgal 的 Whatman#1 滤纸上，去气泡，于 30孵育 30 min8 h，观察颜色变化.2 结果2.1Bit1 基因的扩增采用优化的逆转录方法对人卵巢癌细胞系6Caov3 总 RNA 进行逆转录，然后在 50 L 反应体系中继续扩增反应. 取 RTPCR 扩增产物 10 L，在 10 g/L 琼脂糖凝胶中电泳，可见与预期大小一
12、致的 600 bp 左右的 DNA 片段（图 1）.2.2 重组质粒 pUC19Bit1 的酶切鉴定及测序用 EcoR和BamH双酶切 pUC19 质粒及 PCR 产物，回收 pUC19 载体片段及 Bit1 蛋白基因片段，连接后获得的重组质粒命名为pUC19Bit1.再用 EcoR和 BamH对 pUC19Bit1 质粒进行酶切鉴定（图 2）.鉴定正确的 pUC19Bit1 重组质粒分别作正反向测序，测序结果经与 Genbank 中的 Bit1 序列（NM_016077 ）比较分析表明，扩增得到的 Bit1 蛋白基因片段与原序列完全相符.图 1Bit1 基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略）
13、图 2 重组质粒 pUC19bit1 的 EcoR I，BamHI 双酶切鉴定（略）2.3 重组质粒 pGBKT7Bit1 的酶切分析再分别用 EcoR和 BamH将 Bit1 基因片段从质粒 pUC19Bit1 亚克隆入pGBKT7 载体，重组质粒 pGBKT7Bit1 的酶切鉴定结果 (图 3).2.4HIS3 报告基因表达的检测将含有单纯 AH109 和含有7pGBKT7Bit1 质粒的酵母菌 AH109 单个菌落挑出，分别划线接种于有 Ura，Trp，Leu 和 His 营养缺陷的 SD 平板上，于 30 培养 36 h 后 , 可见单纯 AH109 酵母菌只在 SD/Ura 平板上生
14、长，而含有pGBKT7 Bit1 质粒的 AH109 酵母菌可以在 SD/Ura 和 SD/Trp 平板上生长，在 SD/His 和 SD/Leu 平板上不生长.2.5LacZ 报告基因表达的检测将 pCL1 质粒转化入 AH109 作为阳性对照，将 pGBKT7 Lams 和 pGADT7T 质粒共转化入AH109 作为阴性对照，用 半乳糖苷酶印膜法来检测含pGBKT7Bit1 质粒的 AH109 酵母细胞内 LacZ 报告基因的表达情况.结果显示 LacZ 报告基因不被 Bit1 激活.图 3 重组质粒 pGBKT7bit1 经 EcoRI，BamHI 双酶切鉴定（略）3 讨论酵母双杂交技
15、术是近十几年来发展起来的研究蛋白质蛋白质相互作用的一种方法，其基本原理是：一些转录激活因子（如酵母的 Gal4 蛋白和细菌的 LexA 蛋白） ，往往由两个在结构上可以分开而在功能上又相互独立的结构域构成，这两个结构域只要在同一细胞内能够彼此靠近，就可以激活下游报告基因的表达5.如果8将诱饵蛋白融合到一个结构域上，而将表达文库构建到另一个结构域上，就可以筛选到与诱饵蛋白相互作用蛋白的基因.酵母双杂交Gal4 系统 3 是在系统 1 和系统 2 基础上的改进，具有转化效率高，假阳性率低等优点.酵母双杂交技术是目前应用较多的钓取与已知蛋白直接相互作用分子的方法.对于未知功能的蛋白质，如能钓到与之相
16、互作用的已知蛋白，将对其功能的研究具有明确的指导方向.将诱饵蛋白融合到 Gal4 蛋白的一个结构域上以后，利用此融合蛋白去筛选构建在另一个结构域上的表达文库之前，就必须要验证融合到一个结构域上的诱饵蛋白本身对下游的报告基因有无激活作用，否则便会在 cDNA 文库筛选时出现假阳性结果 .张伟等6 就报告用HBV Pres 与 Pres1 构建的酵母系统即有自激活作用，这样便不能直接用于 cDNA 文库的筛选 . 我们用含有 Bit1 基因的重组质粒转化酵母菌，通过不同方法对报告基因的表达进行检测，结果表明 Bit1基因不具有自激活作用，这样我们就可以直接利用 Bit1 作为诱饵，从人 cDNA 文库中钓取与其相互作用的蛋白.凋亡是一种程序性细胞死亡，在胚胎发生与组织内环境稳定过程中发挥着重要的作用7. 脱落凋亡 (Anoikis)8-9是指细胞与细胞外基质脱粘连而引起的凋亡.整合素与细胞外基质
