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1、1bcrabl 逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病样模型的建立【摘要】 目的: 构建 bcrabl 逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病（CML ）样模型,为深入研究 CML 发病机制和治疗奠定基础. 方法: bcrabl 逆转录病毒 Mig210 载体经 PhoenixAmpo 细胞包装后, 取上清液感染 5FU 处理后的 BALB/c 雄性小鼠骨髓细胞,再经尾静脉移植入经致死剂量 射线（900cGy ）照射的同种雌性受体鼠中. 用形态学、RTPCR 和 Western Blot 鉴定小鼠成模情况. 结果: 小鼠移植 89 wk 后，外周血白细胞达2101031010/L（为对照鼠的 58
2、 倍）,外周血涂片幼稚细胞达到 0.100.20;骨髓粒系细胞显著增高,易见幼稚细胞,肝脾也可见白血病细胞浸润;移植 45 wk 后在受体鼠骨髓和脾脏检出 bcrabl融合基因,89 wk 后在肝脏亦检测出 bcrabl 融合基因,同时在骨髓和脾脏也检测到 bcrabl 融合蛋白.建模成功的小鼠 35 mo 后相继死亡.结论： 成功建立 bcrabl 逆转录病毒介导的小鼠 CML 模型,可用于后续 CML 信号通路和治疗机制的研究. 【关键词】 慢性粒细胞白血病 BCR 融合蛋白 逆转录病毒载体 动物模型0 引言2慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是一
3、种起源于骨髓内异常多能干细胞的骨髓增殖性疾病,其发病机制复杂, 但持续表达的 bcr/abl 融合基因在该病的形成过程中起重要作用.目前在含有 bcr/abl 融合基因的细胞模型上进行研究的报道较多. 对 CML 体内研究的模型主要是基于 bcrabl 转化的造血细胞株在小鼠体内的定殖,以及用 K562 细胞移植裸鼠成瘤后,再接种到免疫缺陷型小鼠致白血病的方法1.而利用逆转录病毒转染的小鼠骨髓移植模型研究人类白血病细胞的发生、发展及其生物学特性,并用来进行实验治疗,是 20 世纪 90 年代以来国外白血病实验研究的新发展2, 国内尚未见报道.本课题拟探索建立 bcrabl 逆转录病毒Mig21
4、0 骨髓转染/移植诱导的小鼠白血病样模型,为后续 CML 信号通路和治疗机制的研究奠定基础.1 材料和方法1.1 材料 BALB/c 小鼠，612 wk 龄，体质量 2123 g, 雌雄各半, 均为清洁级动物,由本校动物中心提供.逆转录病毒载体MIGRP210 由美国 Warren S Pear 教授惠赠 .小鼠急性粒单核白血病细胞株 WEHI3 购于中国医学科学院基础医学细胞中心.RTPCR试剂盒购于 TakaRa 公司;转染试剂 jetPEITM 为 Polyplus 公司产品;聚凝胺(Polybrene)为 Sigma 公司产品;抗 cabl 多克隆抗体、二抗为3抗兔 IgHRP,羊抗鼠
5、 tubulin mAb，ECL 显色试剂盒均购于Cell Signaling 公司;rmIL3 ，rmIL6 ，rmSCF 均购于 PeproTech公司.1.2 方法1.2.1 逆转录病毒上清的制备将 Mig210 和 MigRI 空载在jetPEITM 的介导下转染 PhoenixAmpo 细胞,36 h 后收集第一批病毒上清,72 h 后收集第二批病毒上清, 用有限稀释法感染 NIH3T3细胞计数绿色荧光测病毒滴度,达到 1101111012IU/L 离心过滤, 存于 -80备用.1.2.2 供体鼠骨髓细胞的制备尾静脉注射雄性供体 BALB/c 小鼠 5氟尿嘧啶（5FU ）,4 d 后
6、处死小鼠取骨髓，用 DMEM 预激培养基（含胎牛血清、WEHI3B 细胞上清、青霉素、链霉素、肝素、环丙沙星、L 谷氨酰胺、rmIL3 ，rmIL6 和 rmSCF）培养24 h 后, 计数有核活细胞 .1.2.3 病毒感染骨髓原代细胞使用含 500 mL/L 逆转录病毒上清，10 mmol/L Hepes, 2 mg/L 聚凝胺,pH 7.4 DMEM 培养基,病毒和细胞在 20,1000 g 离心 90 min 共沉降,24 h 的吸附后更换培养基,48 h 后进行第二轮重复上述的转导和共沉降,吸附 2 h 后收4集细胞,用 DHanks 洗涤，计数有核活细胞.1.2.4 感染逆转录病毒的
7、骨髓原代细胞的回输雌性受体小鼠照射前 5 d 接受抗生素直到移植后 2 wk,经 450 cGy 的 射线照射二次, 中间休息 36 h,照射后分 4 组,A 组 15 只:输含有 Mig210 转染的骨髓细胞;B 组 10 只:输含有 MigR1 空载的骨髓细胞；C 组 10 只:回输经 5FU 处理 4 d 后的供体小鼠骨髓细胞；D 组 10 只: DHanks 空白对照.E 组 10 只:未经处理的正常对照组.移植后将受体鼠于 IVC 层流房隔离笼饲养(符合 SPF).1.2.5 移植小鼠成模的鉴定1.2.5.1 细胞形态学检查移植后,每隔 3 d 用剪尾法采血行外周血常规计数和外周血涂
8、片染色分类.第 4 周开始每周分别取各组 1 只小鼠骨髓有核细胞,用 PBS 洗 3 次后将之分成 3 份,一份 PBS 洗后取沉淀涂片染色行形态学检查,一份用于提取总 RNA,存于-80, 一份参照试剂盒提取胞浆总蛋白,Bradford 法测蛋白总量后存于-80. 各组脾和肝脏组织标本也分别处理作相应检测.1.2.5.2RTPCR 检测受体鼠骨髓、脾和肝脏 bcr/abl 融合基因 mRNA 的逆转录参照 TakaLa RTPCR 试剂盒说明书操作步骤得cDNA.人 bcr/abl 融合基因上游引物为55GCAAGCTTACCATGGACATCCGTGG3,下游引物为5GTCGACCTTGC
9、CATCAGAAGC3,扩增片段为 654 bp. PCR扩增条件：94 8 min，94 1 min,57 1 min,72 90 s, 72 8 min,32 个循环 . 小鼠的 actin 基因的上游引物为5ACACTGTGCCCATCTACGAG3,下游引物为5CACAGGATTCCATACCCAAG3, 扩增片段为 336 bp.PCR 产物电泳后在数字化凝胶成像仪上观察，并做 DNA 测序.1.2.5.3Western Blot 法检测受体鼠骨髓和脾脏 P210 蛋白的表达提取骨髓细胞和脾脏组织蛋白, SDSPAGE 凝胶电泳分离蛋白后电转移到 PVDF 膜上 ,转印膜封闭过夜后,
10、分别加入 cabl 抗体及rtubulin 抗体,再分别加入二抗 IgHRP,ECL 法显色后于化学发光成像仪上显影并保存图像.统计学处理：各组数据以 xs 表示,采用 SPSS11.5 统计软件进行 t 检验.2 结果2.1 受体小鼠存活状态观察经 射线照射的受体小鼠次日出现畏冷、恐慌、相拥缩成一团，1 wk 之内出现体毛蓬松、体质量减轻较快、活动力明显减低等，这些症状在 2 wk 后逐渐改善. 第 3 月6时 A 组小鼠皮肤开始出现出血点，第 4 月后相继死去.其他组小鼠中途未见死亡. 所有经 射线照射的受体小鼠，3 wk 时体质量开始恢复，毛发变柔顺、活动增加、反应灵敏、进食及饮水量增加
11、.2.2 受体小鼠血液细胞学检查外周血白细胞计数及涂片分类结果发现：经 射线照射后的小鼠白细胞计数在01090.2109/L,外周血涂片偶见 WBC,Hb,RBC 等其它血常规项目与 E 组相比无明显改变，此后 WBC 数逐渐增多，第 4 wk 后A,B,C,D 组的 WBC 数逐渐增加到 E 组水平（4.51096.0109/L）, 嗜酸粒细胞和单核细胞也稍有增多；A组到 8 wk 时 WBC 总数显著增高,外周血粒细胞明显增高 (图 1),血涂片粒细胞比例大于 0.65 并有幼稚粒细胞出现,到 12 wk 时 WBC 数已达到 2010930109/L,粒细胞比例达到 0.800.90(表
12、 1),幼稚细胞甚至到达 0.30，单核细胞和嗜酸粒细胞的绝对值也增多.A 组小鼠的骨髓象检查发现:移植后第 6 wk 时骨髓增生活跃,各期的粒细胞系统增生,晚期骨髓增生极度活跃, 各期的粒细胞系统显著增生,细胞形态各异,大小不一 ,易见早期细胞（图 2）.A：A 组移植后 7 wk； B：A 组移植后 12 wk； C：E 组对照组.图 1 小鼠外周血涂片瑞氏染色 100（略）7表 1A 组小鼠移植后外周血涂片白细胞随时间的变化（略）A：A 组移植后 8 wk； B： E 组 对照组.图 2 小鼠骨髓涂片瑞氏染色 400（略）2.3 小鼠造血组织病理检查 A 组小鼠在 4 wk 时脾脏开始增
13、大，晚期有大量白血病细胞浸润(图 3)，并侵及肝脏；B,C,D 组的肝脾在前 4 wk 内无差异，由于照射后血液系统受到抑制，脾的大小相对正常组的脾缩小约 0.02 g；B,C,D 组肝组织切片中细胞有轻微水肿，肝血窦扩大.A 组小鼠在移植 12 wk 后相继出血而死（图 4）.A：A 组移植后 8 wk； B： E 组 对照组.图 3 小鼠脾组织切片（箭头所指为白血病细胞）HE 250（略）2.4RTPCR 检测移植小鼠的 bcr/abl 融合基因第 4 wk 时RTPCR 检测 A 组受体鼠骨髓细胞和脾细胞有 bcr/abl 融合基因（654 bp）, 到第 7 周时肝组织有 bcr/ab
14、l 融合基因（图 5）,DNA测序证实序列与 Mig210 上的 bcr/abl 融合基因完全符合（图 6）.其它组小鼠未检测出 bcr/abl 融合基因.8A：A 组移植后 6 wk 小鼠； B：E 组 对照组.图 4 小鼠肝脏组织切片（箭头所指白血病细胞）HE 250（略）M1:100 bp marker; 1:A 组第 30 日脾; 2:A 组第 30 日骨髓; 3:A 组第 50 日骨髓; 4:A 组第 50 日肝; 5:A 组第 50 日脾; 6:B 组第30 日骨髓; 7:B 组第 50 日骨髓; 8:B 组第 50 日脾; 9:C 组第 30 日骨髓; 10:C 组第 50 日骨
15、髓; 11: K562 细胞阳性对照 L; 12: HL60 细胞阴性对照; M2:DL2000 Marker.图 5RTPCR 检测各组小鼠造血组织 bcr/abl 融合基因的表达（略）图 6 移植小鼠造血组织 bcr/abl 融合基因阳性片段 DNA 测序结果（略）2.5Western Blot 法检测移植小鼠 P210 蛋白表达第 5 周时用 Western Blot 法检测到 A 组小鼠骨髓细胞和脾细胞有 P210 蛋白的表达，其它组未检测到有此蛋白的表达(图 7).91： A 组小鼠骨髓 ； 2： A 组小鼠脾； 3：B 组小鼠骨髓；4：D 组小鼠骨髓.图 7Western Blot
16、 检测移植小鼠 P210 蛋白表达（略）3 讨论国际上 CML 动物的建模方法目前主要有以下四种:bcr/abl转化的造血细胞株在小鼠体内的定殖模型,主要用于研究 bcr/abl 融合基因的结构功能和药理试验；CML 原代骨髓细胞移植入免疫缺陷小鼠模型,主要适用于 CML 祖细胞的移植和生物学特性研究以及抗 CML 治疗性研究；bcr/abl 转基因小鼠模型,主要用于模拟bcr/abl 诱导的淋巴细胞白血病,且成活率低,技术含量高；bcr/abl逆转录病毒骨髓转染/移植诱导的白血病模型 ,该模型主要用于研究BCR/ABL 不同变异体（P190,P210 和 P230）和不同结构域（DD区,SH2 结合区,Dbllike 区,PH 区和
