《BCR-ABL癌蛋白片段的表达、纯化及其抗血清的制备》由会员分享，可在线阅读，更多相关《BCR-ABL癌蛋白片段的表达、纯化及其抗血清的制备（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1BCR/ABL 癌蛋白片段的表达、纯化及其抗血清的制备作者：梁英民蒋姗姗孙强吴绒丽陈萍李荣周鹏王键韩骅 【关键词】 基因表达 关键词: bcr/abl;基因表达;融合蛋白;抗血清 摘 要: 目的 克隆并表达 bcr/abl 融合基因片段，并制备其抗血清. 方法 PCR 扩增包含蛋白融合点的 bcr/abl 癌基因片段，序列测定后克隆入带有 His 标签的原核表达载体 pET-16b，转化宿主菌BL21，IPTG 诱导表达，SDS-PAGE 分析表达结果，Ni-NTA 树脂亲和纯化，皮下多点注射免疫小鼠，ELISA 确认抗血清的滴度. 结果 PCR 扩增得到大小约 523bp 的目的片段，序列
2、测定表明与发表序列完全一致;得到了一种新的癌基因 bcr/abl 片段的原核表达载体pET-16b-bcr/abl，在 BL21 中表达可见于 Mr21103 处有一蛋白新生带，表达的 BCR/ABL 蛋白免疫小鼠后，ELESA 确认抗血清的滴度12000. 结论 成功的克隆、表达了 bcr/abl 融合基因片段，并制备了相应的抗血清. Keywords:bcr/abl;gene expression;fusion protein;immune serum 2Abstract:AIM To clone and to express bcr/abl fusion gene fragment an
3、d to produce immune serum against the expressed fusion protein.METHODS PCR-amplified bcr/abl gene fragment was inserted into plasmid pET-16b with His tagto form a new plasmid pET-16-bcr/abl（pEb ）.The BCR/ABL fusion protein was expressed in E.coli BL21trans-formed with pEb and induced with IPTG.The e
4、xpressed pro-tein was purified by affinity resin-Ni-NTA and analyzed by SDS-PAGE.In order to produce anti-serum，Mice were im-munized by subcutaneously multi-site injection with BCR/ABL protein.The anti-serum was assayed by ELISA.RESULTS Molecular weight of the PCR-aimplified bcr/abl gene fragment wh
5、ich was consistent with the published se-quence was about523bp.Plasmid pEb was constructed.The molecular size of BCR/ABL protein expression was about Mr21103 .The titer of the BCR/ABL protein anti-serum was more than12000.CONCLUSION Fragment of bcr/abl fu-sion gene is successfully cloned and express
6、ed.The antiserum of BCR/ABL protein fragment has been produced. 0 引言 3慢性粒细胞白血病（Chronic myelogenous leukemia，CML）是起源于骨髓造血干细胞的恶性肿瘤.绝大多数CML 患者的肿瘤细胞带有染色体异常，即 922 号染色体易位，形成特征性的费城染色体（Pheladophia，ph 染色体） 1，2 .在分子水平，这一染色体易位造成 bcr 基因和 abl 基因的融合，表达的 BCR/ABL 融合蛋白具有持续性的激酶活性，引起细胞的转化2 .Bcr/abl 融合蛋白被认为是 CML 特异性肿瘤抗
7、原，可作为CML 诊断和治疗的指标3-6 .我们用 PCR 扩增了 BCR/ABL 融合蛋白的基因片段，并在大肠杆菌中进行了表达.表达产物经纯化复性后，用于免疫小鼠，得到可识别该抗原的小鼠抗血清. 1 材料和方法 1.1 细菌和质粒 大肠杆菌 XL-10gold 由本室保存.质粒 pET-16b 及大肠杆菌 BL21 均来自 Nav-agene 公司.带有人bcr/abl（b3a2）融合基因的质粒 pGD210 由本校附属唐都医院血液科刘立博士提供. 1.2 引物设计与 bcr/abl 融合基因表达质粒的构建 DNA 重组所用试剂来自 Promega、宝生物工程公司及华美生物工程公司 .以质粒
8、 pGD210 为模板，用 PCR 扩增了 bcr/abl 基因跨越融合点的 523bp 基因片段（93aa-265aa）.PCR 引物的序列为:上游引物:5-CTCGAGACGTTCCTGATCTCCTCT;下游引物:5-4GGATCCTTAGTAGTTGCTTGGGACC-CA.PCR 产物经电泳回收纯化后插入 pGEM-T 载体（Promega ） ，进行 DNA 序列分析.从正确克隆的载体中，用 Xho I 和 BamH I 双酶切下含有 bcr/abl 融合基因插入片段，插入质粒 pET-16b，得到表达 BCR/ABL 融合蛋白的质粒 pET-bcr/abl（Fig1） ，以下简称
9、 pEb. 1.3 重组蛋白的诱导表达和纯化 用表达质粒 pEb 转化大肠杆菌 BL21，加入 IPTG 至终浓度 1mmolL-1 ，诱导不同时间后，收集菌体.悬浮于 PBS，超声裂菌，离心弃去上清. 向沉淀中加入 2molL-1 尿素，离心除去杂蛋白.再用8molL-1 尿素溶解沉淀的蛋白，在 Ni-NTA-agarose 柱（Vector 公司）上进行亲和层析. 用 250mmolL -1 咪唑洗脱.收集洗脱的蛋白，透析后冻干保存. 图 1 略 1.4 抗血清的制备 BALB/c 小鼠由第四军医大学实验动物中心提供，用 50g 基因重组的 BCR/ABL 融合蛋白与等量的福氏佐剂混后皮下
10、多点注射，每周一次，第四周腹腔注射加强一次，加强免疫后 14 天取血，分离血清备用. 1.5 酶联免疫试验（ELISA ） 向 96 孔板中加入纯化的5BCR/ABL 融合蛋白（5g/L ）100L，4包被过夜.加入稀释的经免疫小鼠的血清与未经免疫小鼠的血清，血清稀释度均为1500，11000 ，12000，14000，18000，116000，设一阴性对照孔， 37水浴 1h，加入酶标抗体，371h，TMB显色 1530min，酶联免疫检测仪测定，测定波长为 492nm. 1.6 DNA 序列分析 按说明书用 PE 公司的荧光 DNA 序列测定试剂盒（Big-dye）进行序列测定反应，用 3
11、10 型 DNA 序列测定仪进行电泳及结果分析. 2 结果 2.1 bcr/abl 基因的亚克隆 为表达 BCR/ABL 融合蛋白融合点两侧约 200 个氨基酸的片段.以全长 bcr/abl 基因为模板，用 PCR扩增了这一片段的 cD-NA.Fig2 显示 523bp 的目的片段被扩增出来.将这一片段插入 T 载体后，进行 DNA 序列分析，但在 5和 3端分别插入了设计的 Xho I 和 BamH I 酶切位点. 图 2 略 2.2 BCR/ABL 融合蛋白的诱导表达 用 bcr/abl 表达质粒pEb 转化大肠杆菌 BL21，培养后用 IPTG 进行诱导.SDS-PAGE 分析结果表明，
12、与用 pET-16b 转化的 BL21 及未转化质粒的 BL21 裂6解产物相比，在 21kd 处有一新生蛋白带，与预期的融合蛋白分子大小相同.灰度扫描显示 IPTG 诱导 3h 后融合蛋白的表达约占细菌总蛋白的 20%. 2.3 BCR/ABL 融合蛋白的纯化 用 Ni-NTA-a-garose 亲和层析柱进行 BCR/ABL 融合蛋白的纯化. 收集蛋白峰， PBS 透析后，进行 SDS-PAGE 分析（Fig3）.表达的融合蛋白被纯化为单一条带. 2.4 BCR/ABL 融合蛋白在小鼠中的抗体应答 收集免疫小鼠的抗血清，ELISA 检测结果见图 4，与正常对照比较，接受融合蛋白免疫的小鼠产
13、生了较高滴度的血清，说明基因重组的 BCR/ABL融合蛋白对小鼠具有免疫原性. 图 3 图 4 略 3 讨论 bcr/abl 融合基因是 CML 的分子标记，bcr/abl 融合基因编码一个分子量为 Mr21104 的融合蛋白.由于融合蛋白连接区的氨基酸序列是其他任何正常蛋白质不具有的，被认为是 CML 细胞所特有的.BCR/ABL 融合蛋白是一种胞浆内蛋白，研究 bcr/abl 融合蛋白在细胞表面的表达的类型和该融合蛋白的免疫学特点对开展 CML 的免疫治疗有重要意义3-6 .然而，由于融合蛋白很难从患者体内7获得，而且在细胞内加工和提呈的效率也难以检测，为此，本文用体外基因重组的方法获得了
14、 bcr/abl 融合蛋白的原核表达产物，经纯化复性后，用于免疫小鼠，得到了可识别该抗原的小鼠抗血清，为随后的单克隆抗体制备及免疫治疗的研究奠定了基础. 参考文献: 1Kurzrock R，Gutterman JU，Talpaz M.The molecular genetics of Philadelphia chromosome-positive leukemias J.N Engl J Med，1988;319（15）:990-998. 2Shtivelman E，Lifshitz B，Gale RP，Canaani E.Fused transcript of abl and bcr ge
15、nes in chronic myelogenous leukaemia J.Na-ture，1985;315（6020）:550-554. 3Liang Y M，Sun Q，Jiang S S，Cheng P，Wang J S，Liu L，Han H.Expression of PTD-bcr/abl fusion oncoprotein fragment carrying protein transduction domain and its transmembrane transportation J .Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med
16、Univ） ，2001;22 （7）:Cover2. 4Feng Q，Sun BZ，Zhao YT，Sun K，Yan Z，Han W，Zhang YQ.Study on the cleavage ability of three ribozymes specific to the different sites of bcr-abl fusion gene J.Di-si Junyi Dax-ue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，1999;20（ 4）:284-287. 85Bocchia M，Wentworth PA，Southwood S，Sidney J，McGraw K，Scheinberg DA，Sette A.Specific binding of leukemia onco-gene fusion protein
