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1、1Bcl2 和 bad 蛋白表达与皮肤血管瘤的相关性研究【摘要 】 目的： 探讨 bcl2 和 bad 基因在血管瘤组织中的表达及相关性。方法： 采用免疫组织化学方法检测人皮肤血管瘤增生期、退化期及正常皮肤组织中 bcl2 和 bad 基因的表达水平。 结果：Bcl2 在增生期血管瘤内皮细胞的表达明显高于退化期血管瘤内皮细胞和正常皮肤组织血管内皮细胞（P0.01） ；Bcl2 在退化期血管瘤内皮细胞的表达与正常皮肤组织血管内皮细胞相比，差异无显著性（P0.05） 。bad 在退化期血管瘤内皮细胞的表达明显高于增生期血管瘤内皮细胞和正常皮肤组织血管内皮细胞（P0.01） 。结论： bcl2 和
2、bad 参与了血管瘤的发生、发展和退化；Bcl2 通过抑制内皮细胞凋亡而促进血管瘤的增生；bad 通过诱导血管瘤内皮细胞的凋亡而促进血管瘤由增生向退化的转变。 【关键词】 bcl2； bad； 血管瘤； 凋亡； 免疫组织化学皮肤血管瘤是好发于婴幼儿的一种常见良性肿瘤。内皮细胞过度增殖和血管迅速生长是血管瘤病理组织学的最大特点，也是血管瘤发生的实质。根据内皮细胞生长、摄取 3H胸苷、肥大细胞计数、纤维细胞形成以及脂肪浸润等将血管瘤分为：增生期、退化期2和退化完成期三个时期，但至今其病理演变的确切机制仍不十分清楚。近年来研究表明血管瘤是一种血管过度形成的良性肿瘤，血管内皮细胞的过度增殖和血管形成在
3、血管瘤病理演变过程中起着很重要的作用，而关于影响血管内皮细胞的过度增殖和血管形成因素的研究越来越引起科研工作者的重视。细胞凋亡（apoptosis）是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定由基因调控的细胞主动死亡过程。血管瘤自发消退的过程中无炎症反应，无组织坏死，非常符合凋亡的过程，因此许多研究者推测可能是由于增殖的血管内皮细胞凋亡导致血管瘤自发消退。Bcl2 和 bad 是在调控细胞凋亡过程中的比较重要的蛋白质，它们在许多恶性肿瘤中的研究比较多，而在血管瘤这种良性肿瘤中的研究，尤其是在血管瘤不同时期表达的研究，国内外尚未见报道。本课题采用免疫组织化学方法、图像分析技术检测了 Bcl2 和
4、 bad 在血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤血管中的表达，以探讨 Bcl2 和 bad 在血管瘤由增生向退化转变过程中的作用机制。1 材料和方法11 材料111 材料来源 收集武汉大学人民医院病理科20022006 年皮肤血管瘤存档蜡块 50 例，其中男性 25 例，女性325 例。血管瘤所在的部位主要有头皮、前额、眼睑、耳背、颈部、背部、上臂、大腿、手和足的皮肤等。患者术前均未做任何辅助性治疗。112 材料分组 蜡块切片厚 5m，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。常规 HE 染色和免疫组织化学 SP 法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclea
5、r antigen，PCNA ） ，按 Mulliken 分类标准并结合 PCNA 的表达进行分组：增生期血管瘤 22 例，退化期血管瘤 28 例，另取瘤组织周围正常皮肤组织 5 例作对照。12 主要试剂和仪器121 主要试剂即用型鼠抗人 PCNA 单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司） ；即用型兔抗人因子相关抗原多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司） ；浓缩型鼠抗人 bad 单克隆抗体（美国 Santa Cruz 公司） ；浓缩型鼠抗人 Bcl2 单克隆抗体（美国Santa Cruz 公司） ；超敏即用型 SP 通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司） ；DAB 显色试盒及多聚赖氨酸
6、（北京中山生物技术有限公司） 。122 主要仪器 YWY781 型医用微波仪(浙江临安电子器4材厂)；家用高压锅。13 方法131 常规 HE 染色 取材、固定、脱水、透明、切片和 HE染色132 免疫组织化学 SP 法检测 bad、Bcl2 、PCNA 和因子相关抗原主要步骤： 组织切片 5m，常规脱蜡至水，蒸馏水洗； 3%过氧化氢，37孵育 10min 以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS 洗 45min； bad、Bcl2 采用微波抗原修复（3档，10min） ，PCNA 采用高压抗原修复， 因子相关抗原采用胃酶消化修复抗原，PBS 洗 45min； 正常羊血清 37 孵育 10min以减
7、少非特异性反应； 一抗（bad， 1: 150；Bcl2 ，1:50)37孵育 1 h，PBS 洗 45min； 生物素标记的二抗，37孵育10 min，PBS 洗 45min； 链霉菌抗生物素蛋白 过氧化物酶复合物 37孵育 10 min，PBS 洗 45min； DAB 显色液显色，自来水冲洗终止反应； 苏木精复染，脱水，透明，封片。用 PBS代替一抗作为阴性对照，人扁桃体作为 bad、Bcl2 的阳性对照，人正常皮肤表皮作为 PCNA 的阳性对照。14 免疫组织化学结果判断 Bcl2、Bcl2 和因子相关抗5原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，PCNA 以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性反
8、应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。采用 HPIAS2000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对 Bcl2 和的 bad 表达进行定量分析，每张切片随机选取 5 个完整而不重叠的高倍镜视野（ 400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率（阳性面积率单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积100） 。以每例 5 个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。15 统计学处理对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和 SNKq 检验，检验水准 为 0.05。
9、2 结果21 HE 染色正常皮肤组织中的毛细血管由 12 个内皮细胞围成，管壁较薄，内皮细胞胞质薄，仅含核的部分略厚，内皮细胞核扁平。增生期血管瘤组织中可见内皮细胞增生呈团索状，内皮细胞核肥大而淡染；内皮细胞有的围成血管腔，有的不围成血管腔而呈团块状。退化期血管瘤组织中可见内皮细胞数量减少，内皮细胞核扁平；血管腔增大，血管间结缔组织增多。有时在同一个标本中，6可以同时见到典型的增生期和退化期区域。22 PCNA 的表达增生期血管瘤内皮细胞核肥大，核内弥漫分布棕黄色颗粒，PCNA 表达强。退化期血管瘤内皮细胞核扁平，大多数细胞核被苏木精染成蓝色，少数胞核内有少量棕黄色颗粒，PCNA 表达弱。23
10、 因子相关抗原的表达增生期和退化期血管瘤内皮细胞胞浆内弥漫分布棕黄色颗粒。24 Bcl2 的表达增生期血管瘤内皮细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒；退化期血管瘤内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒沉积；正常皮肤组织血管内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒沉积。图像分析结果显示见表 1。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P0.01)。经q 检验，增生期组与退化期组之间、增生期组与正常皮肤组之间，Bcl2 的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P 0.01) ，退化期组与正常皮肤组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性（P 0.05） ，见表 1。表 1 血管瘤不同时期 Bcl2 表达的平均光密度和阳性面积率（略）7注
11、：* 增生期组与退化期组比较， P0.01； 增生期组与正常皮肤组比较，P0.01；# 退化期组与正常皮肤组比较，P 0.05 。25 bad 的表达退化期血管瘤内皮细胞胞浆内棕黄色颗粒较多；增生期血管瘤内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒；正常皮肤组织血管内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒。图像分析结果显示见表 2 。经 q 检验，退化期组与增生期组之间、退化期组与正常皮肤组之间，bad 的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P0.01) ，增生期组与正常皮肤组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P 0.05)，见表 2。表 2 血管瘤不同时期 bad 表达的平均光密度和阳性面积率（略）注：* 增生期组
12、与退化期组比较，P0.01； 退化期组与正常皮肤组比较， P0.01；# 正常皮肤组与增生期组比较，P 0.05。3 讨论血管瘤（hemangiomas）是一种血管过度形成的良性肿瘤，好发于婴幼儿。由于所观察的人群及年龄段不同，血管瘤的发病率8有很大的差异，通常在 1%2%之间1,2 。不同种族性别及家族史的存在与否都影响着血管瘤的发病率，高加索人的发病率高于有色人种3 。对于大多数患者，血管瘤经过一个增生期后会自然停止生长并逐渐消退，但仍有部分患者的血管瘤可持续发展或因其生长部位特殊而具有一定的危险性，持续发展的血管瘤可产生溃疡、出血、感染等一系列并发症，而位于颜面、颅内及口腔的血管瘤可引起
13、明显的畸形及功能障碍，严重影响患者的身心健康。临床上通常将血管瘤分为毛细血管瘤、海绵状血管瘤、蔓状血管瘤和混合型血管瘤，其中毛细血管瘤又进一步分为葡萄酒色斑和草莓状血管瘤，这种分类方法将临床表现作为分类依据，没有根据细胞生物学特性进行区别，它给治疗方式的选择带来混乱。1982 年，Mulliken 和Glowacki4根据血管瘤病变的临床表现及组织学特点将其分为两大类，即血管瘤（hemangiomas）和血管畸形(vascular malformation),并且根据内皮细胞生长 摄取 3H胸苷、肥大细胞计数、纤维细胞形成以及脂肪浸润等将血管瘤分为：增生期（Proliferative phas
14、e） 、退化期(Involuting phase)和退化完成期(Involuted phase)三个时期。随着此分类法的出现，人们开始正确认识这种疾病。虽然血管瘤各期的组织形态学特征已经通过免疫组织化学方法鉴定出来，但至今其病理演变的确切机制仍不十分清楚。血管瘤是一种血管形成性疾病，血管瘤的自然病程包括增生期、退化期和退化完成期三个阶段，病理表现主要为：在增生期血管瘤内皮细胞过度增生，表现出胚胎性内皮细胞特性，瘤组织中发生稠密9的新血管形成，在未知因素的控制下，血管瘤从增生期转变为退化期直至退化完成期，内皮细胞增生逐渐停止，大量内皮细胞趋向凋亡，而原先形成的新生血管逐渐成熟并随后转向退化。国内
15、外学者对血管瘤增生和发展的临床及细胞特征进行了大量研究，发现了许多影响血管形成的正性和负性因子均与血管瘤的病理发展有关，同时确定了一些促进血管瘤内皮细胞异常增殖的生长因子和激素。这些成分包括各种血管形成因子、细胞外基质成分、蛋白酶及其抑制物、雌激素、自由基、NO 等，它们对内皮细胞迁移、分化、血管样结构形成以及细胞间的相互作用等都起着重要作用。近年来研究表明5,6 ，血管内皮细胞的过度增殖和血管形成（angiogenesis）在血管瘤病理演变过程中发挥重要作用。 我们在近几年的研究中,对血管瘤的发生、发展的病理机制进行了一系列研究，我们认为在血管瘤病理发生过程中，存在血管内皮细胞本身生理、生化
16、和基因的异常；而血管瘤由增生向退化转变的原因则是细胞间的信号传递和内皮细胞内基因表达的改变。细胞凋亡（apoptosis）是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定由基因调控的细胞主动死亡过程。血管瘤自发消退的过程中无炎症反应，无组织坏死，非常符合凋亡的过程，因此许多研究者推测可能是由于增殖的血管内皮细胞凋亡导致血管瘤自发消退。Iwata6等证实了血管瘤组织中存在较高的细胞凋亡率。 Razon等7报道应用 TUNEL 法测定，发现在增殖期血管瘤中细胞凋亡水平低，而在退化期血管瘤中凋亡水平则升高 5 倍，免疫荧光双标10记实验表明至少 1/3 的凋亡细胞是内皮细胞。程立新等8报道Bcl2 这一凋亡抑制因子在海绵状血管瘤及蔓状血管瘤组织中的表达较毛细血管
