《2,3吲哚醌诱导人神经母细胞瘤细胞凋亡作用及机制》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2,3吲哚醌诱导人神经母细胞瘤细胞凋亡作用及机制（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、12,3 吲哚醌诱导人神经母细胞瘤细胞凋亡作用及机制【摘要】 目的 观察 2,3吲哚醌（ISA）经 Caspase3 途径诱导人神经母细胞瘤凋亡的作用及机制。方法 以不同浓度ISA（ 0、100、200、 400 mol/L）作用于 SHSY5Y 细胞 48 h，采用 Hocehst33258/PI 荧光染色技术观察细胞凋亡的形态学改变，流式细胞术检测细胞凋亡率的变化，Western blot 方法检测Caspase 激活的脱氧核糖核酸酶抑制剂（ICAD）蛋白表达的变化。结果 Hochest33258/PI 荧光染色可见核浓缩及核碎裂等典型的细胞凋亡形态学特征。100、200 、400 mol
2、/L ISA 处理组SHSY5Y 细胞的凋亡率均明显高于对照组（F=111.30,P0.05） 。随着 ISA 浓度的升高，表达活化 Caspase3 的细胞数逐渐增加（F=5.622，P0.05） 。Western blot 检测到其下游作用底物ICAD 被降解。结论 ISA 能诱导 SHSY5Y 细胞凋亡，该作用可能通过激活 Caspase3 来实现。 【关键词】 吲哚醌类 神经母细胞瘤 细胞凋亡 ABSTRACT Objective To explore the effects and mechanisim of caspase3 activation in ISAinduced apo
3、ptosis of human neuroblastoma cell line SHSY5Y through caspase3 pathway. Methods The apoptosis was detected by flow cytometry (FCM) and Hochest33258/PI 2staining, and the activity of caspase3 determined by FCM. Western blot was used to analyze inhibitor of caspaseactivated DNAse (ICAD), the substrat
4、e of Caspase3 after treatment of ISA at different concentrations (0, 100, 200, 400 mol/L). Results The morphological features of nuclear condensation and fragmentation were observed after exposure to 400 mol/L of ISA. The apoptotic rate of SHSY5Y cells, after treatment with ISA (100, 200, 400 mol/L)
5、, was significantly higher than that in the control. The activation of caspase3 increased with an elevation of ISA density (F=5.622,P0.05). Inhibitor of caspaseactivated DNase (ICAD) protein, the substrate of Caspase3, was degraded. Conclusion Isatin could induce apoptosis of SHSY5Y cells, which, pr
6、obably, is completed through the activation of caspase3. KEY WORDS Indolequinones; Neuroblastoma; Apoptosis 2,3吲哚醌（ISA）是维持龙虾生存所必需的一种内源性吲哚，是我国独创类抗癌药物靛玉红的先导化合物。ISA 是成分单一的有机天然物质，化学结构明确，毒性低，副作用小, 对正常细胞有保护作用，有促进人和小鼠神经母细胞瘤细胞凋亡的作用1。课题组的前期实验已经证明，ISA 可以通过影响靶细胞生长周期和3下调血管内皮生长因子（VEGF）的作用进而达到抑制肿瘤细胞生长的作用2,3。本文将在上
7、述研究的基础上进一步探讨 ISA 诱导SHSY5Y 细胞凋亡的作用及机制，同时观察 Caspase3 活化情况。1 材料与方法 1.1 主要试剂 ISA 购自上海元吉化工有限公司，DMSO 溶解，母液浓度为 5 mmol/L,4 保存，实验时用无血清培养基稀释至实验浓度（DMSO 的体积分数0.01%） 。脱氧核糖核酸酶抑制剂（ICAD）和 actin 的抗体购自北京博奥森公司； ECL 发光试剂购于北京普利莱公司；藻红蛋白（PE）结合的单克隆活化的Caspase3 抗体凋亡试剂盒(PEconjugated monoclonal active Caspase3 antibody apoptos
8、is KIT) 购自 BD PharMingen 公司；Hochest33258、碘化丙啶 (PI)购自美国 Sigma 公司。 1.2 细胞株及其培养 SHSY5Y 细胞株购自中国协和基础学院细胞中心，用含体积分数 0.15 胎牛血清（杭州四季青生物公司）的 HDMEM 培养基(GIBCO 公司产品) ，在含体积分数 0.05 CO2、37 饱和湿度条件下培养。 1.3 荧光染色 取对数生长期的 SHSY5Y 细胞，以 107/L 的密度接种于培养瓶中，培养 24 h 后，加入 ISA，随机分为对照组（不含 ISA）及不4同浓度的 ISA 处理组（ 100、200、400 mol/L） ，收
9、集细胞于 1.5 mL 的 EP 管中,用冷的 PBS 漂洗 2 次，离心去上清后，每管中均加入 Hochest33258、PI 染液使其终浓度分别为 40 mg/L 和 50 mg/L，37 避光孵育 30 min，取出细胞悬液 20 L 滴于载玻片上，盖上盖玻片，紫外线激发，进行拍照。实验重复 3 次。 1.4 PI 染色、流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化 收集对照组（不含 ISA）及不同浓度（100、200、400 mol/L）ISA 处理组细胞， PBS 洗涤 2 次后，PBS 重悬，缓慢注入预冷的体积分数 0.70 乙醇中，30 固定 24 h 以上，1 000 r/min离心 5 m
10、in，去除乙醇，PBS 清洗 1 次，离心弃去 PBS，加 50 mg/L PI(含 10 mg/L RNaseA) 0.5 mL 于避光处染色 30 min，用流式细胞仪进行检测。实验重复 3 次。用亚 G1 期的细胞比率表示细胞凋亡率。 1.5 流式细胞术检测表达活化的 Caspase3 细胞 4 收集对照组（不含 ISA）及不同浓度（100、200、400 mol/L）ISA 处理组细胞， PBS 洗涤 2 次后，PBS 重悬，逐滴注入预冷的 40 g/L 多聚甲醛中固定 30 min，离心去上清， PBS 漂洗。加入体积分数 0.001 Tritonx100 室温孵育 20 min，离
11、心去上清，加入 PE 结合的单克隆活化 Caspase3 抗体避光室温孵育 30 min，过筛后流式细胞仪检测。标记了 PE 的抗体只与活化的Caspase3 结合，不与酶原形式的 Caspase3 结合，应用流式细胞仪即能分辨出表达活化的 Caspase3 细胞。实验重复 3 次。 51.6 Western blot 检测 Caspase3 底物的变化 4 收集对照组（不含 ISA）及不同浓度（100、200、400 mol/L）ISA 处理组细胞于 1.5 mL 的 EP 管中，PBS 洗涤 2 次后，每管中加入 150 L 细胞裂解液在冰上裂解 30 min，4 下以 12 000 r/
12、min 离心 5 min,收集上清液, 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。蛋白质样品与上样 buffer 按 41 混匀，煮沸 3 min。每孔上样 40 g， 120 g/L 的 SDSPAGE 胶分离样品。于室温恒流 40 mA (1.5 h)将蛋白转至 PVDF 膜上，用 50 g/L 的脱脂奶粉（溶于 TBS)室温封闭 2 h，将膜与溶于一抗稀释液(10 g/L 脱脂奶粉, 溶于 TBS中)中的一抗 (兔抗人 actin 抗体 1300；兔抗人 ICAD 抗体)封于塑胶袋中，4 过夜，室温孵育 2 h，TBST 洗 15 min 共 3 次，将膜与溶于二抗稀释液(10 g/L 脱脂奶粉，溶于
13、 TBS 中)中的二抗室温孵育 3 h，TBST 洗 15 min 共 3 次，将膜包在保鲜膜中，加入ECL 发光试剂，暗室暴光，显影，定影，对 X 线底片进行扫描,对结果进行吸光度分析。实验重复 3 次。 1.7 统计学处理 采用 SPSS 11.5 统计学软件进行数据处理，数据间比较采用单因素重复测量方差分析。 2 结 果 2.1 凋亡细胞形态学变化 400 mol/L ISA 处理组在荧光显微镜下观察到典型的凋亡形态学改变：细胞质浓缩、核染色质聚集。而对照组细胞核呈均匀的蓝6色荧光。 2.2 细胞凋亡率 100、200、400 mol/L 的 ISA 均可诱导 SHSY5Y 细胞发生凋亡
14、，细胞凋亡率随药物浓度增加而增加，分别为（7.990.10）%、 （17.831.65）%和（ 18.201.23）%，对照组为（2.780.04）% ，不同浓度 ISA 处理组与对照组比较，差异有显著性（F=111.30,P0.05)。 2.3 活化的 Caspase3 表达 经 0、100、200 、400 mol/L ISA 处理 SHSY5Y 细胞 48 h,表达活化的 Caspase3 的细胞数随着药物浓度的增大逐渐增多，表达未活化的 Caspase3 的 SHSY5Y 细胞数则逐渐减少（F=5.622,P0.05 ） 。见表 1。表 1 不同浓度 ISA 作用SHSY5Y 细胞后活
15、化 Caspase3 变化(略) 2.4 Caspase3 底物 ICAD 蛋白的变化 对照组细胞表达一定量的 ICAD 蛋白，用不同浓度 ISA 处理SHSY5Y 细胞 48 h，随着药物浓度的增加 ICAD 的表达量逐渐降低（图 1） 。 3 讨 论 神经母细胞瘤是儿童常见恶性肿瘤，恶性程度高。虽然近年来不断出现新的化疗药物，但神经母细胞瘤病人的无瘤生存率仍然很低，再加上化疗药物本身毒性很高，寻找新一代低毒高效的抗癌药物是国内外研究者所期待的。近几年来，天然的吲哚类化合物因为毒性7低而引起人们的关注，并迅速成为抗癌药物研究的热点。目前，ISA单独作用于神经母细胞瘤研究还未见报道。本实验选用
16、人神经母细胞瘤 SHSY5Y 细胞株作为靶细胞株，研究新型抗肿瘤化合物 ISA诱导凋亡的作用机制。 细胞永生化是肿瘤形成的一个重要原因，而细胞凋亡失控又是造成细胞永生化的直接原因。因此，抑制肿瘤细胞生长的机制，主要是诱导肿瘤细胞凋亡，而 Caspase 和 Bcl2 家族蛋白与细胞凋亡密切相关4,尤其是 bcl2/bax 降低，可引起线粒体膜电位的改变5，进一步激活 Caspase3 诱导细胞发生凋亡。有研究报道，Caspase3 在神经母细胞瘤中高度表达，并且其高度表达可以诱导神经母细胞瘤凋亡6,7。本课题组以往研究显示，ISA 作用于SHSY5Y 细胞后，抗凋亡基因 bcl2 mRNA 表达明显下降，促凋亡基因 bax 未发现明显改变，bcl2/bax 降低 8。在凋亡的
