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1、0北京师范大学珠海分校开 题 报 告姓名（小组成员）： 学 院（系、所）： 学 科 专 业： 导 师 姓 名： 1开 题 时 间：姓名 性别 入学时间院系 工程技术学院 专业 生物技术 研究方向 植物组织培养中文 胡萝卜愈伤组织培养论文题目 英文 Carrot callus cultivating2论文工作计划简述（开题报告内容）1、本论文课题国内外概况和文献综述：应用细胞的全能性(totipotency)理论，即已经分化的细胞仍然具有发育成完整个体的潜能，可以将成熟胡萝卜直根的部分组织培养成完整胡萝卜植株。国内外研究者在探讨胡萝卜愈伤组织的成因时，发现影响胡萝卜愈伤组织的发生频率主要有基因型
2、、外植体、培养基、激素等因素。胡萝卜的基因型是影响其离体培养再生能力的重要因素。 对于不同品种的胡萝卜种子,大多数研究者认为利用其刚萌发的无菌苗的下胚轴诱导愈伤组织，出愈率较高 1-3。同一基因型的不同外植体其愈伤组织的发生能力有明显差异，这与不同外植体的分化程度和脱分化能力不同有关。近年来的研究表明，以胡萝卜下胚轴为外植体出愈率要高于子叶和贮藏根 1,3,4。此外，杨宁等（1999）选取胡萝卜贮藏根的皮层、木质部及韧皮部为外植体，发现从韧皮部诱导出的愈伤组织有较好的生长效果 5。在胡萝卜愈伤组织诱导和分化中，基本培养基成分对胚性愈伤组织的诱导率和质量均有显著影响，一般认为 MS 培养基对体细
3、胞胚的发生更为有利。但也有认为 B5 基础培养基略优于 MS 基础培养基 1。不同的激素种类、浓度及其组合对愈伤组织的诱导率有显著影响。已有的研究结果表明，在培养基中加入 2,4-D,6-BA,BA,KT 等，会影响胚性愈伤组织的发生。2,4-D 的浓度从 0.110.0 mg/L 不等，6-BA 的浓度从 0.24.5mg/L 不等，BA 的浓度从 0.51.0mg/L 不等，KT 的浓度从 0.22.0mg/L 不等 2,3,6。此外还有研究结果表明，2,4-D/KT 比值是影响愈伤组织形成的关键因素，随着比值的增大，愈伤组织诱导率有逐渐升高的趋势 7。32、本论文课题的理论和实际应用意义
4、：胡萝卜（Daucus carrot） ，属于十字花科植物，是一种十分重要的蔬菜植物。由于其营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培。中国是农业大国,胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用.因此,加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。近些年来,随着生物技术与分子生物学技术的快速发展，作为生物技术研究的理想材料，许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展，特别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多。
5、因此继续深入研究还是很有必要的。 此外，由于市面上的胡萝卜价格比较便宜，材料易得，而且在组织培养方面容易诱导发生，我们可以通过这个实验熟悉植物组培。43、论文的基本内容、结构框架以及要突破的难点：（1）材料及设备：6 个培养皿、培养瓶、吸水纸、镊子、解剖刀、无菌操作台、胡萝卜直根（长度至少 200mm,直径不小于 40mm） 、大约 20% (体积比)浓度的次氯酸钙溶液1000ml、75%酒精、MS 培养基、2,4-D、KT（2）实验步骤设计：A.培养基的配制:取无菌水 200ml依次加入母液:大量元素 25ml、微量元素 2.5ml、铁盐 2.5ml、有机元素2.5ml、重复 6 次，在 6
6、 个培养瓶中加入生长素 2,4-D、KT（用量如下表）诱导率=（形成愈伤组织的外植体数/接种外植体数）100%在个瓶中称取并加入琼脂 2g，蔗糖 7.5g放微波炉里融化实验号 基本培养基 2,4-D（mg/L）KT （mg/L）1 MS 0 02 MS 0 0.53 MS 1 04 MS 1 0.55 MS 2 1.56 MS 4 2.55每瓶定容 500ml调 PH(5.86.0)包扎后高温灭菌，待凝固后备用B.外植体的清洗和消毒：用小刷在流动的自来水下洗刷胡萝卜,除去表面的屑粒。用小刀给其削去表皮，并切成小段放入烧杯中。先用 75%酒精对胡萝卜直根消毒 5min，用无菌吸水纸吸干，再用 1
7、0%的次氯酸钙溶液消毒 10min，放入无菌水中漂洗 23 次，用无菌吸水纸吸干待用。C.接种：在无菌操作台上操作，把消毒好的胡萝卜直根放入无菌培养皿中，用消毒好的小刀沿截面将其横切成厚度 1mm 左右的小圆片，然后将小圆片的韧皮部和木质部切去，留下形成层，再将形成层切成大约长 5mm、宽 5mm、高 1mm的小长块。将凝固的培养基融化后适量倒入 6 个培养皿，用镊子将切好的胡萝卜外植体接种在固体培养基上，每个培养皿 5 块，按上表放入 6 个培养皿中，表上编号。放于黑暗处 25条件下进行暗培养。D.培养：接种后的培养皿放在无菌箱里培养,培养期间定期更换培养基,避免营养不足影响效果。并且要定期
8、消毒,严格控制温度,定时光照,使实验免受无关变量影响。注意观察记录外植体的变化，是否有污染或诱导出愈伤组织。（3）实验注意事项：A.防火。实验中要经常用酒精消毒、用酒精灯烧镊子、刀具，注意安全。B.无菌操作。超净工作台的消毒，在工作台内部所用仪器的消毒以及工作台面上的用品要有合理的布局。手要用酒精擦干净；镊子和刀经常在火焰上烧；锥形瓶、手不要放在盛材料的培养皿上方。C.材料处理。材料不易切得过小，消毒时间不易过长。切取外植体时尽量取胡萝卜的形成层进行接种，形成层相对木质部和韧皮部较容易诱导出愈伤组织,而且要把胡萝卜的消毒接触部位切除干净。6D.培养基配制。按实际配制含量准确吸取母液，PH 的调
9、节（PH 计的正确操作）都是制备 MS 培养基的重要操作。要先灭菌再凝固。（4）实验可能遇到的困难：A.实验过程中所需要用到的实验用具以及培养基没有经过严格的灭菌，实验污染导致实验失败。B.培养基中植物生长激素的浓度不对，导致出愈率低。74、论文计划及进度：理论日程(可参考)约两周后，观察并计算胡萝卜的诱导率期间作如下记录简表:记录人: 温度: 湿度: 日光照时间:记录项目 日期 培养物数目 肉眼观测形态变化 污染物数目 所作处理 备注实验事项 时 间分离胡萝卜直根的新鲜外植体及接种进入培养基 第 1 天愈伤组织的显著增殖 约 14 天实验号 基本培养基 2,4-D（mg/L） KT （mg/
10、L） 诱导率（%）1 MS 0 0 2 MS 0 0.5 3 MS 1 0 4 MS 1 0.5 5 MS 2 1.5 6 MS 4 2.5 85、主要参考文献：1张娅,曾君祉,周志勇,等.胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立J.植物学通报,2005,22(增刊):7-42.2郑回勇,郑金贵,等.胡萝卜再生体系及高效遗传转化体系的建立J.广西农业科学,2002(5):237-241.3尹文兵,李丽娟,黄勤妮,李艳红.胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究J.山西师范大学学报，2004(2):72-76.4高金秋,于丽杰.胡萝卜体细胞胚再生系统的建立J.北方园艺,2009(8):73-77.5杨宁,郭勇.胡萝卜细胞培养产生胡萝卜素的研究J.广西植物,1999,19(1),84-886胡蓉.胡萝卜愈伤组织建立中的几个问题探讨J.川北教育学院学报：自然科学版，1995(2):7,16.7陈淑仪.诱导胡萝卜愈伤组织实验的探究.教学仪器与实验，2007:12-13.9开题报告概况（包括单位、地点、出席人数及对论文工作计划提出的意见和建议）：10指导教师意见：签名： 年 月 日指导组召集人意见：签名： 年 月 日
