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1、卵黄免疫球蛋白及其应用研究进展陈阿琴,杨志刚,俞颂东(浙江大学动物科学学院, 动物分子营养教育部重点实验室, 浙江杭州null 310029)l 2004 07 13null DSM Anull cI| 1002 1280 ( 2005) 03 0028 04null ms| R979. 5Knull1 null 卵黄免疫球蛋白 IgY与哺乳动物 IgG相比具有许多突出的优点,现已成为当今生物科学研究的热点。随着研究的深入,其应用也越来越广泛。本文介绍了卵黄抗体的结构与性质、制备方法及其在动物生产中的应用研究进展。1oM null 卵黄抗体;应用Te: 陈阿琴( 1977年 ) ,女, 在读硕
2、士,动物营养与饲料科学专业。null null 抗体(免疫球蛋白, Ig)是机体受到外来抗原物质刺激后,机体免疫系统细胞产生的可以特异性地识别和结合外来抗原并使之失活的一类球蛋白。鸡(或者说禽类)经特定抗原免疫后,可产生相应的特异性抗体,并不断储存于卵黄中, 这种抗体称为卵黄抗体( Immunoglobu lin of yolk, IgY ),它是卵黄中唯一的免疫球蛋白,具有特异性和针对性, 无毒副作用,广泛用于人类和畜禽疾病的诊断与防治。1null IgYnull null 禽类的体液免疫系统是由法氏囊控制的。机体受到外界特异抗原刺激后, 会产生一系列免疫应答反应, 从而激发 B细胞分化为浆
3、细胞,浆细胞则分泌大量特异性抗体进入到体液中。产蛋禽能以类似于哺乳动物的胎盘传递抗体的方式选择性地将血液循环中的 IgY转移到成熟的卵泡 (即卵黄)中。Locken等 1发现这种选择性的转移过程是由卵巢的 IgY受体决定的,它只允许母源血液中存在的 IgY选择性地向卵泡转移, 而血液中的 IgM 和 IgA则被运送到输卵管中与输卵管分泌的卵白蛋白一起进入到鸡蛋白中。M orr ison等 2指出, 产蛋鸡(或禽 )的卵黄对抗体有浓集作用,因此卵黄中的抗体浓度要高于血清。2null IgY2. 1null IgY的结构特征null 鸡 IgY的分子量约为 180ku,等电点为 6. 5 7. 5
4、,含氮量为 14. 8%。 IgY最初被认为是免疫球蛋白 IgG的类似物, 但随着研究的深入,人们发现 IgY可能是哺乳动物 IgG和 IgE的祖先 3。IgG和 IgY在结构上有很多差异 (图 1 ), IgY的重链有 1个可变区, 4个稳定区( Cnull1 Cnull4), 没有铰链区, 而哺乳动物 IgG只有 3个稳定区 ( Cnull1 Cnull3)。最近的研究表明, IgY 的疏水基团多于IgG 4。比较 IgG和 IgY的 C-端序列发现, IgGnullnull nullm1null IgGIgYmnull28null 中国兽药杂志null null null null nu
5、ll null null null null 2005, 39( 3): 28 31 /陈阿琴, 等null的 Cnull2和 Cnull3区与 IgY的 Cnull3和 Cnull4区十分相似。2. 2null IgY的化学特征null IgY抗酸、耐热, 且稳定性也非常好。1null20稀释的 IgY与 1 m ol/L HC l作用 30m in后活性降低到 1null2, 作用 60 m in活性才完全消失 5。 IgY制剂于 4 null贮存 5年或室温下放置 6个月,抗体活性没有受到影响 6 ; IgY溶解于生理盐水中在 4 null贮存 6 7年, 抗体活性降低不超过 5%。在通
6、常情况下, IgY基本能耐受巴氏消毒, 37 null 下其活性基本无明显改变 7 。研究还发现, IgY具有耐高渗性能 (在 60%的高浓度蔗糖溶液中仍有活性) 8和很好的耐反复冻融的特性。李春晖等 10试验表明, IgY经胃蛋白酶酶解后 24 h仍保持其中和抗体的活性,所以口服的卵黄制品能通过消化道, 在到达肠道时仍能保存足够的活力以抑制病原菌的侵染。由于禽类与哺乳动物生物系统发育的差距, 两者的亲缘关系较疏远,哺乳动物的蛋白质抗原在禽体内更易产生特异性较高的抗体, 所以 IgY的生化特性优于哺乳动物抗体 11。许多研究表明, IgY不能活化哺乳动物的补体系统 12 ,不与血清中存在的类风
7、湿因子( RF)起反应 13 ,不与蛋白质 A和 G起反应 14 , 不影响哺乳动物 IgG发挥作用, 且不与哺乳动物的 Fc受体起反应 12。因此 IgY可以逃逸干扰,免疫检测可以避免假阳性反应的发生, 可用于实验室的诊断和研究, 如 EL ISA、免疫电泳、琼脂糖凝胶扩散试验等。3null IgY!3. 1null 母鸡免疫3. 1. 1null 应用传统的蛋白质抗原免疫null 首先要根据生产 IgY的不同目的选择合适的鸡群, 如用于治疗目的的 IgY的生产应选用 SPF鸡, 而用于预防目的的 IgY的生产可以选用商品蛋鸡。免疫方法可选用皮下、皮内、肌肉、静脉、腹股沟、法氏囊注射或通过口
8、服等,也可将多种免疫方法综合使用。3. 1. 2null 应用基因免疫制备基因专一性 IgYnull 该方法是以携带目的基因的基因表达载体作为免疫原免疫产蛋母鸡,使目的基因在鸡体内高效表达目的抗原,引起鸡体液或细胞介导的免疫应答, 产生抗目的基因所编码蛋白质的抗体 15。基因专一性抗体通过基因组和免疫原性分析选择合适的基因片段编码的蛋白质作为特异性抗原。由于用这种方法得到的IgY抗体带有相应的基因序列信息, 故又称为基因专一性 IgY抗体。利用基因在鸡体内表达蛋白质抗原,省去抗原体外表达、纯化等中间步骤, 加快了抗体的制备过程, 而且也可避免抗原制备过程中蛋白质的污染。3. 2null IgY
9、的分离与纯化null 卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪, 其比例为 1null2。大部分蛋白质是脂蛋白,存在于卵黄颗粒中, 不溶于水,只有 null、null、null-卵黄球蛋白是水溶性的, IgY是 null-卵黄球蛋白。因此如何去除高浓度的脂类对于 IgY的分离纯化是至关重要的。IgY分离纯化的原则是简便、高效、经济。目前常用的分离方法主要有:有机物沉淀法、有剂溶剂沉淀法、水稀释法 (WD法 )、超临界气体提取法 ( SFE法)、去污剂分离法等。为了将 IgY从水溶液中分离出来,人们主要通过超滤法或沉淀法来完成。 IgY是蛋白质, 而蛋白质的提纯主要采用层析技术, 因此,人们在进行 IgY
10、的纯化时常用的方法是凝胶层析和离子交换层析。目前使用的提取、纯化方法各有优缺点:沉淀法简单、经济, 但其提取的物质纯度低;亲和层析能得到高纯度的特异性卵黄抗体, 但因产率低、费用高而不能得到大规模应用, 仅适用于科研; WD法和 SFE法具有工艺简便、生产成本较低、产品纯度和回收率高等优点, 比较适合大规模工业化生产 16。总的来说,在实际生产过程中, 应优化组合各种沉淀方法, 制备更加经济、高产率的层析柱。4null IgY34. 1null 传统 IgY的应用4. 1. 1null 抗致病菌null 仔猪大肠杆菌性腹泻病与产肠毒素大肠杆菌菌毛介导的粘附作用和产肠毒素密切相关。用禽菌毛抗原免
11、疫产蛋母鸡制备的 IgY,能降低腹泻的发生程度和仔猪的死亡率, 并且有利于仔猪增重。Yokoyam a等 17 研究发现, 产肠毒素型大肠杆菌的 IgY可预防断奶仔猪和犊牛因产肠毒素型大肠杆菌引起的腹泻,从而对幼畜起到被动免疫的作用。王忠泽等 18制备了抗大肠杆菌O157nullH 7鸡 IgY, 实验表明其对乳鼠感染模型有明显的保护作用, 是一种有潜力的治疗肠道感染的药物。高云英等 19制备了鸡抗猪大肠杆菌高免 IgY, 经预防、攻毒试验及临床治疗观察,发现其对仔猪免疫保护率可达 90%以上,攻毒保护率 98%以上,临床治愈率 95%以上。ELISA试验表明鸡抗沙门氏菌或抗鼠沙门氏菌 IgY
12、具有很高的特异活性 20。用免疫荧光技术和免疫电镜技术对 IgY的特异结合活性作进一步的研究,null29nullnull 2005, 39( 3): 28 31 /陈阿琴,等null null null null null null null null null 中国兽药杂志发现沙门氏菌特异性 IgY能结合到沙门氏菌表面的抗原上,并导致细菌表面结构改变。马超英等 21指出鸡 IgY与牛珀至宝丹配合使用对内毒素休克有一定的疗效。N ikoo等 22通过腹腔注射、口服和在饲料中添加的方式研究抗鳗弧菌 IgY的免疫作用, 发现这三种方式均能提高虹鳟鱼的抗病力。尽管研究取得了一些效果, 但还有一些实
13、际问题尚待进一步解决, 而且其作用机理仍不清楚。4. 1. 2null 抗病毒null 轮状病毒是婴儿和幼龄动物腹泻的病原之一。 IgY与初乳作用机理相似, 因而研制抗猪流行性腹泻病毒 ( PEDV )卵黄抗体 ( PEDV-IgY ),可防止猪流行性腹泻的流行,降低该病造成的损失 23。何丽华等 24 用家蚕核型多角体病毒(NPV )制备的 IgY对家蚕血液脓病有较好的预防效果。穆海菠等 25从高免卵黄抗体中分离提纯特异性新城疫抗体, 试验表明具有明显的中和病毒的作用,特异性中和指数可达到 630 957以上, 且使用纯化后的高免 IgY安全、高效、无任何不良反应。目前,新城疫和法氏囊 Ig
14、Y的应用已被广为接受,而且可与多种病原同时免疫鸡体, 制成多价 IgY用于紧急预防和治疗多种疾病。应用禽流感病毒灭活苗免疫蛋鸡,从抗体效价高的卵黄中提取禽流感特异性高免球蛋白的研究也已进行, 并取得了一定的进展 26, 27 。4. 1. 3null 其他null 卵黄抗体除了在疾病防治方面的应用外, 还可用于制备细菌检测试剂盒及在亲和层析中作为某些活性物质 (抗原 )的有效配体。随着一些抗生素在欧洲被禁止使用, 抗生素替代品的研究日益受到重视,对 IgY的研究就是其中的热点之一。4. 2null 基因专一性 IgY的应用null 基因专一性 IgY抗体可作为基因和蛋白质之间的null桥梁nu
15、ll,这是因为基因专一性抗体携带有特定基因的编码序列。因此,在实际应用过程中,在不同的生物样品中发现的靶蛋白均可找到其基因来源,这尤其有利于未知蛋白质的确定。这种方法称为抗体介导的基因与蛋白质的确定( Ant-ibody-M ediated Identification of Genes and Proteins,AM IGAP)。利用基因专一性抗体筛选和确定生物样本中的未知蛋白质,进而在组织或细胞中定位它们的特异性靶标, 测定新蛋白质潜在的功能,分析其表达谱,当得到足够的蛋白质组数据后, 便可形成一个完整的相关数据库 16, 28。新蛋白的确定可进一步作为一些重要疾病的诊断标记或治疗的靶标。
16、利用基因专一性 IgY及其靶抗原的信息,单克隆或治疗性抗体也会得到进一步的发展 29。5nullIgY是一种多克隆抗体 ( polyclonal antibodies),廉价而有效。卵黄作为特异抗体 IgY的来源有许多优点,如母鸡易于饲养, 费用不高, 为制备大剂量抗体提供了经济可行的丰富资源; 收集鸡蛋方便, 对鸡体无损伤,而且不受时间、地域和季节的限制。然而在实际应用过程中, 要使其成为一种方便、成本低廉、无环境污染、切实有效的产品, 则仍需进一步研究。ID: 1 Locken MR, Roth TF. Ana lysis of m aternal IgG subpopulationsw h ich are t
