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1、Real-time PCR PCR发展历程 第一代 PCR 终点 PCR 第二代 PCR 实时 PCR（ Real-time PCR） 第三代 PCR 数字 PCR（ Digital PCR） 实时荧光 PCR的基本原理 通过对 PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板 定量 （标准曲线）及 定性的分析。 PCR动力学曲线和四个阶段 三个重要的概念 基线（ Baseline) 阈值 (Threshold) Ct 基线（ Baseline) 是背景曲线的一段，从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未超出背景。 阈值 (Threshold)
2、阈值 （ threshold ） ： 荧光超过本底时的临界数值。 荧光域值的默认设置是 3 15个循环的荧光信号的标准偏差的 10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要保证在指数增长期。 Ct值 Ct值的定义 ： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增 循环次数 C(t) value PCR扩增的数学模型 荧光定量 PCR技术的主要优点 各种荧光 PCR仪器 Real-time PCR过程检测模式 SYBR Green 水解探针 Taqman探针（最常见） Taqman MGB探针（凯普） 杂交探针 分子信标（ Molecular B
3、eacon） 双杂交探针（ FRET探针） SYBR Green SYBR Green染料法的特点 Taqman探针 Taqman MGB探针 HPV Real-time PCR产品主要厂家 市场主要荧光 PCR HPV检测产品 荧 光 PCR 产 品 13高危 HPV 凯 普 SFDA 港 龙 SFDA 上海之江生物 SFDA 12+2 高危 HPV HPV 凯 普 SFDA 罗 氏 FDA、 SFDA 雅培 无 凯普 12+2 High-risk HPV 适用的主要荧光 PCR仪： LineGene 9660、 ABI 7500、 Rotor-Gene 6000、 Mx3005P、 Lig
4、htCycler 480、 ABI ViiA 7 PCR中常见问题分析 标本的采集与储存 标本的制备 核酸纯化 试剂准备、加样 扩增、检测 结果分析 报告解释 标本的采集与储存 1、标本的采集 严格按照要求采样，尽可能减少粘液和血液，采集到尽可能多的宫颈脱落细胞 标本的采集与储存 2、储存条件 提取前的原始标本 一周内提取 4 一周后提取 -20 提取后的 HPV DNA 检测前 一周内检测 4 一周后检测 -20 检测后 -20 标本的制备 核酸纯化 原理： 煮沸法：表面活性剂（如 Triton X-100、 SDS等）煮沸 1、优点 简单、快捷、方便 2、缺点 HPV DNA纯度较差，含有血红素、蛋白、 脂类等 PCR抑制剂。 试剂准备、加样 1、试剂配制的均一性、分装的均一性 2、常用试剂的分装和储存 -20 ，避免反复冻融 3、加样的准确性和重复性 扩增、检测 影响因素：引物、探针、仪器设备状态 阳性对照 监控系统故障 阴性对照 监控污染 结果分析 ABI 仪器 1、设置基线： 2、设置阈值线： 基线和阴性对照的上方，同时保证在指数增长期。 结果分析 1、整体扩增曲线的观察 2、阴性对照分析 3、阳性对照分析 报告解释 结果可能出现： 1、假阳性：交叉污染、扩增子污染 2、假阴性：低于检测下限、抑制物未去除、检测体系有缺陷 谢谢 !
