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1、课题总结范文 LOGO酶免课题总结汇报人常海涛主要内容ELISA简介ELISA的基本原理和方法ELISA的试剂ELISA操作要点1234免疫标记技术免疫标记技术放射物标记技术酶标技术免疫荧光技术其他标记技术酶联免疫吸附技术酶免疫组化技术双抗体夹心法竞争法双抗原夹心法间接法双位一点法用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性。 ELISA简介1971年瑞典学者Engvail和Perlmannn,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法（称为酶联免疫吸附试验）。 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一项基本的、常规
2、的、成熟的检测技术。 由于免疫标志物（抗原/抗体）具有无法替代的临场意义，以及ELISA技术具有操作简便、技术可靠、试剂方便易得等优点，特别是90年代以来ELISA技术的灵敏度和特异性都得到了显著的提高与完善，由此，ELISA成为传染病学（肝炎、HIV、TORCH等），肿瘤标志物以及内分泌等各种临床免疫指标的检测的不可替代的主导技术。 ELISA基本原理先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。 测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。 用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。 然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。
3、最初发展的免疫酶测定方法，是使酶与抗体或抗原结合，用以检查组织中相应的抗原或抗体的存在。 后来发展为将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。 这种技术就是目前应用最广的酶联免疫吸附试验，俗称ELISA(enzyme linkedimmunosorbent assay)。 ELISA基本的实验过程?包被将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化?抗原抗体反应先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定?酶促反应在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色ELISA基本的实验过程ELISA方法双
4、抗体夹心法本法首先用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如果待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg（乙肝表面抗原）、HBeAg（乙肝病毒e抗原）、AFP、hCG等。 只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。 双抗体夹心法双抗体夹心法操作步骤将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物洗涤除去其他未结
5、合的物质加酶标抗体生成抗体待测抗原酶标记抗体的复合物彻底洗涤未结合的酶标抗体加底物进行酶催化反应根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定ELISA方法间接法间接法是检测抗体常用的方法。 其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。 间接法操作步骤包被固相载体:用已知抗原包被固相载体加待检标本:使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体加底物显色根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定E
6、LISA方法竞争法（测抗体）当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。 其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。 标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。 如抗原为高纯度的，可直接包被固相。 如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。 洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。 竞争法操作步骤用已知特异性抗体包被固相载体测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合对照管只加一定量酶标抗原与固相
7、抗体直接结合分别洗涤除去未结合的成分加底物显色分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量ELISA试剂试剂盒ELISA试剂盒在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。 ELISA中有三个必要的试剂免疫吸附剂、结合物和酶的底物。 完整的ELISA试剂盒包含以下各组分1.已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；2.酶标记的抗原或抗体（结合物）；3.酶的底物；4.阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；5.结合物及标本的稀释液；6.洗涤液；7.酶反应终止液。 固相载体固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。
8、 ELISA载体的形状主要有三种微量滴定板、小珠和小试管。 以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为812的96孔式。 ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。 ELISA板材质可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。 聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。 聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但用于间接法测抗体
9、时空白值较大。 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。 聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的ELISA板在使用前须事先检查其性能。 ELISA板材质与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。 作为ELISA固相载体，聚氯乙烯的特点为质软板薄，可剪割，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。 聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 小珠在ELISA中，用作固相载体的小珠一般为直径0.6cm的圆珠，表面经磨砂处理后吸附面积大大增加。 ELISA板孔的
10、吸附面积约为200mm2，小珠均为1000mm2，将近ELISA板孔的5倍。 吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加。 再者，球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于最佳反应状态，因此珠式ELISA的反应往往更为灵敏。 小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底，使用特殊的洗涤器，使小珠在洗涤过程中滚动淋洗，其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好。 但由于磨砂工艺的难度较大，小珠的均一性较差。 小试管小试管作为固相载体也有较大的吸附表面，而且标本的反应量也相应增加。 板式及珠式ELISA的标本量一般为100-200ul，而小试管可根据需要加大反应体积，标本反应量的增加有助于试验
11、敏感性的提高。 小试管还可以当作比色杯，最后直接放入分光光度计中比色。 也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为ELISA固相载体的。 其优点是表面积极大，反应在悬液中进行，其速率与液相反应近似。 以含铁的磁性微粒作为ELISA固相载体，反应后用磁铁的吸引进行分离，洗涤方便，试剂盒一般均配以特殊仪器。 将抗原或抗体固定的过程称为包被(coating)。 换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。 这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。 载体
12、对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。 包被结合物结合物即酶标记的抗体（或抗原），是ELISA中最关键的试剂。 良好的结合物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。 结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。 此外，结合物尚要有良好的稳定性。 酶用于ELISA的酶应符合以下要求纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。 最好在受检标本中不存在相同的酶。
13、 另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。 在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase,AP)。 在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色黄色棕色蓝色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶44-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色红色400500葡萄糖氧化酶AB
14、TS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色深蓝色405420-半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色360,450420ELISA操作要点标本的采取和保存除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。 血清标本宜在新鲜时检测。 如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。 如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。 一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4，超过一周测定的需低温冰存。 冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。 混浊或
15、有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。 反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。 保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。 试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。 ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。 自配的缓冲液应用pH计测量较正。 从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。 试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 加样在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。 加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。 每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的
