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1、湖北当阳一中 沈满弟 限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性 DNA 探针来检测是否存在基因变异。 当待测 DNA 序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片 段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。 如：（2005 湖北3）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。 检测这种碱基序列改变必须使用的酶是 A.解旋酶 B.DNA 连接酶 C.限制性内切酶 D.RNA 聚合酶 解析：根据碱基互补配对原则可采用 DNA 分子杂交原理或 DNA 探针的方法。采用加热等 一定的技术手段将患者的 DNA 分子片段与正常人的 DNA 分子片段
2、单链放在一起，互补的碱基 序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链。解 旋酶的作用是 DNA 分子在复制或转录时将 DNA 双链解开，在本题中加热也可以解开达到目的， 所以不是必须的酶；DNA 连接酶和限制性内切酶都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶 只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割 DNA 分子的基本骨架上脱氧核糖和 磷酸之间的磷酸二酯键，DNA 连接酶的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口缝合起来。 而 RNA 聚合酶则是在基因转录过程中促进核糖核苷酸形成 mRNA 分子的酶，本题就是采用限 制性内切酶分析法解题的。必须使用的酶就是
3、限制性内切酶，故选 C。 根据 DNA 分子杂交原理知，将患者的 DNA 分子片段与正常人的 DNA 分子片段单链放在 一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两 条游离的单链，有无双链便是区别，为什么又要用限制性内切酶将其切开再杂交呢？回答这 个问题我们先看看。 2008 天津 30-下图为人 -珠蛋白基因与其 mRNA 杂交的示意图， -表示基因的不 同功能区。从本题看出基因的单链的编码区与其转录的成熟的 mRNA 之间可以杂交形成杂合链，但 是它们两者之间不仅不是完全互补，相反有两个内含子对应的单链部分所含有的上 百个核苷酸，mRNA 根本没有对应互
4、补的部分，这就说明它们之间相差很大也能够杂交，只 不过结果有突起部分而已，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因只有一个碱基发生突变，难 道用正常基因转录的 mRNA 就不能与只突变一个碱基的基因杂交形成杂合链吗？应该是肯定 可以,如果这样来检测，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因的检测结果是相同的，就找不 到区别，无法鉴别。 所以必须采用限制性内切酶分析法来检测才有效，具体是先找到一种限制性内切酶，切 开控制镰刀型细胞贫血症基因的对应部位的正常基因，这样就形成两短段，也同同一种酶来 切镰刀型细胞贫血症基因，因为镰刀型细胞贫血症基因发生了一个碱基的突变，这样相同的 限制性内切酶就无法切开，就还是完整的
5、一长段，在用以上三段对应的已标记的mRNA 进行 杂交（此过程可以不用任何酶，通过控制温度来打开氢键和连结氢键），然后电泳，如果出 现两短段的则是正常基因，如果只出现一长段则是突变基因，如果都有的说明两者都存在， 可视为杂合。利用相关知识点命题的请看如下高考试题。 2007 江苏38单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。镰刀型细胞贫血症是 一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。已知红细胞正常个体的基因型为 BB、Bb ，镰 刀型细胞贫血症患者的基因型为 bb。有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携带者，为了能 生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。下图为其产前核酸分子杂交诊断和
6、结果示 意图。 (1)从图中可见，该基因突变是由于 碱基对改变(或 A 变成 T) 引起的。巧合的是，这个位 点的突变使得原来正常基因的限制酶切割位点丢失。正常基因该区域上有 3 个酶切位点，突 变基因上只有 2 个酶切位点，经限制酶切割后，凝胶电泳分离酶切片段，与探针杂交后可显 示出不同的带谱，正常基因显示 2 条，突变基因显示 1 条。 (2)DNA 或 RNA分子探针要用 放射性同位素(或荧光分子等) 等标记。利用核酸分子杂交 原理，根据图中突变基因的核苷酸序列(ACGTGTT)，写出作为探针的核糖核苷酸序列 UGCACAA 。 (3)根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿是否会患有镰刀型细胞
7、贫血症。这对夫妇 4 次妊娠的 胎儿-lII-4 中基因型 BB 的个体是 一 l 和一 4 ，Bb 的个体是 一 3 ，bb 的个 体是 一 2 。 解析:比较基因B 和和突变后的基因 b 的碱基组成，发现它们的差别仅是B 基因一条链 某一位点上的碱基 A 突变成 b 基因一条链某一位点上的碱基 T（实质上对应的另一条链上的 碱基也发生了改变）。据图观察，正常基因 B 经限制酶切割后，凝胶电泳分裂酶切片段，与 探针杂交后可显示出不同的带谱都是二条，而突变后的基因 b 经限制酶切割后，与探针杂交 后可显示出不同的带谱都是一条。所以，在分析推断胎儿-1-4 的基因型时，可以这 样认为：基因型 B
8、b 的个体同时带有 B 基因和 b 基因，所以其应同时含有与 B 基因对应的二 条带谱，与 b 基因对应的一条带谱（这也可以从-1 和-2 得到验证）。符合这个条件的仅 有-3。同理，基因型为 BB 的个体应仅有与 B 基因相对应的二条带谱，符合条件的是-1 和-4。bb 的个体是只能是含有与 b 基因相对应的一条带谱，为-2。作为探针的必要条 件之一是要易于识别，所以可用放射性同位素或荧光分子等进行标记。既可以用脱氧核苷酸 链作探针，也可以用核糖核苷酸链作探针，题干中明确要求用核糖核苷酸链，所以，特别要 注意当 DNA 链上的碱基是 A 时，作探针用的 RNA 链上的碱基应为 U。 通过如上
9、分析可知，限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性 DNA 探针来检测 的方法，即是酶切和核酸分子杂交两种技术的综合分析方法。核酸分子杂交技术在体外进行 的时候可以不用相关酶，但是限制性内切酶无法用温度等外界环境的控制来代替。限制性内 切酶分析法现在的使用很广泛，如：在柯萨奇 B 组病毒 B1-B6 型检测及分型中的应用 - 利用 GCG 软件对柯萨奇 B1-B6 型病毒 cDNA 全序列进行了限制性内切酶酶切位点的分析，目 前从理论上推测该方法几乎可以检测所有遗传病的变异基因，近几年高考试题也是屡屡出现, 所以特别提醒广大师生在高考复习备考过程中应多加重视。 -ACGT GTT- -ACGAGTT- 正常的血红蛋白基因 B 突变的血红蛋白基因 b 图注: 限制酶酶切点 突变碱基 探针杂交区域 带谱 I II 1 1 2 2 3 4 凝胶电泳分离酶切片与探针杂交显示的带谱
