《SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳简单原理和步骤ppt课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳简单原理和步骤ppt课件.ppt（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验十五 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 一 概述 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 是蛋白质分析过程中最常用的技术 通常在电泳分离时 其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少 分子量大小和形态 但如在PAGE中加入阴离子去污剂SDS SDS将蛋白质的二硫键 氢键及梳水键打开 使蛋白质变性 SDS将包裹在变性蛋白表面 使蛋白质成为刚性分子 同时 由于SDS带有大量负电荷 使蛋白质本身带有的电荷可忽略 至此情况下 不同蛋白质分子的迁移率主要决定于带有的SDS量 即蛋白质分子的大小 因此利用SDS PAGE可测定蛋白质的分子量 2 二 试剂 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液 Acr和Bis
2、称取丙烯酰胺30g 甲叉双丙烯酰胺0 8g 加水至100ml 过滤后存于棕色瓶中 于4 保存 4X分离胶缓冲液称取Tris18 17g 加入10 SDS贮备液4ml 用12mol LHCl调pH至8 8 定容至100ml 4X浓缩胶缓冲液称取Tris6 06g 加入10 SDS4ml 用l2mol LHCI调pH至6 8 定容至100ml 10 过硫酸铵称取过硫酸铵0 5g 加水至5ml 本储存液应现配现用 10X电极缓冲液称取Tris30g 甘氨酸144g 加入10 SDSl00ml 定容至1000ml 2X样品缓冲液称取蔗糖2g 或甘油2m1 加入10 SDS2ml 溴酚蓝0 25mg 浓
3、缩胶缓冲液2 5ml 巯基乙醇0 5ml 加水定容至10ml 染色液称取考马斯亮蓝R 2502 5g 加入甲醇450ml 冰乙酸l00ml 水650ml 脱色液甲醇100ml 冰乙酸100ml 加水800m1 3 三 操作步骤 1 分离胶的制备 1 根据所分离的蛋白质分子量选择分离胶的浓度 制备不同浓度的凝胶所需的储备液可参考下表 该配方可配制0 75mm厚 10cmX7cm的凝胶 在配制凝胶时 将水 30 Acr和Bis储液 4X分离胶储液混合完全后 真空脱气5分钟 然后加入过硫酸胺和TEMED 立即准备灌制凝胶 2 将混合液充分混合后 缓慢地倒入已经固定在夹心垂直平板电泳槽里的狭槽中 注意
4、在本操作过程中不能产生任何气泡 然后尽快地在分离胶的上面轻轻地覆盖一层水 3 置于室温下15 30分钟 使凝胶聚合完全 在水相和凝胶的交界处有一明显的亮线 除去上层水相 然后再用水或浓缩胶缓冲液 0 125mol m1Tris HCI pH6 8 0 1 SDS 洗凝胶表面 准备灌制浓缩胶 4 不同浓度凝胶的制备 5 2 浓缩胶制备的方法 1 将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体储备液0 6ml 浓缩胶缓冲液888u1 水2ml 10 过硫酸铵56ul TEMEDl0ul混合均匀后 立即灌胶 2 将预先制备好的浓缩胶慢慢地灌进狭槽中 然后将所需的样品梳 形成加样孔 插于夹心槽上部 并上下轻轻拉动梳子
5、 小心地去除粘附在梳齿顶部的小气泡 待聚合完全后即可拔去梳子 准备电泳 6 3 样品制备及电泳 1 样品处理 蛋白质样品和分子量标准蛋白质在上样电泳前均需变性 通常是将样品蛋白质溶液与等体积的样品缓冲液混合后置于eppendorf管中 将混合物置于95 100 加热5分钟 立即置于冰上 或于 20 储存 以便再次分析时使用 2 上样 样品制备好以后 即可上样电泳 先将样品梳子移去 用双蒸水淋洗每个样品孔 然后在样品孔中加入电泳缓冲液 同时在电泳槽中也加满电泳缓冲液 处理完毕后 根据实验的需要加样电泳 3 电泳 通常使用稳流的方式进行电泳 电流一般为18mA 时间大约3 4小时 7 4 凝胶的染色与脱色 电泳完毕后 倒去电泳缓冲液 取出夹心槽 小心地取出凝胶 置于染色液中染色4小时 并不时地轻轻晃动 染色完毕后 倒去染色液 用少量水淋洗凝胶 然后置于脱色液中脱色 并轻轻晃动 脱色至蓝色背景消失为止 此凝胶即可用于分析 考马斯亮蓝检测灵敏度为0 3 1ug 蛋白带 银染检测灵敏度为0 1 1 0ng 蛋白带 比考马斯亮蓝检测灵敏度高100 1000倍 8 9 此课件下载可自行编辑修改 供参考 感谢您的支持 我们努力做得更好 10
