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1、十五 生物技术药物分析 1 概念 2 分类 生物技术药物 重组DNA药物 重组蛋白质药物 采用DNA重组技术或其他新生物技术 生产的治疗和预防药物 1 重组蛋白质或重组多肽药物包括 细胞因子类 rIFN IL 2 EPO等 抗细胞素治疗 CD4可溶性受体等 重组溶血栓类 rSK rSAK等 人源化单克隆抗体制剂 重组疫苗和菌苗制剂 2 重组DNA药物包括 v寡核苷酸药物 反义核酸等 v基因药物 腺病毒 IL 2 腺相关病毒 凝 血 因子 腺病毒 P53 v细胞治疗制剂 抗原致敏的人树突状细胞 vDNA疫苗 治疗乙型肝炎 爱滋病的核酸疫 苗等 v生物技术药物的质质量控制与传统传统 生产产方法 所
2、得产产品有本质质的差别别 可能会含有用传传 统统生产产方法不可能存在的有害杂质杂质 例如 在细细菌中表达的产产品可能有内毒素 致敏原 在动动物细细胞中表达的产产品可能有DNA杂杂 质质和病毒 重组产品质量控制上存在的难点 v建立重组药物的生物学活性测定方法 v理化测定标准品的稳定性 v人源化单抗中的人源化程度检测方法及标准研究 v重组人白蛋白等大剂量重组产品安全性评价问题 v反义核酸药物理化特性测定和效力测定 即如何评价 反义核酸的体内及体外活力 v基因治疗药物的安全性评价包括反转录病毒 生物分 布和效力测定 vDNA疫苗的安全性和效力检测方法研究 v干细胞治疗产品的质量标准的建立 干细胞鉴定
3、及活 力测定 生物技术药物的质量控制 生物技术药物的特点 1 来源 活的生物体 细菌或细胞 2 结构 复杂 包括组成 空间结构 3 生产 涉及生物材料和生物学过程 发 酵 细胞培养 分离纯化等 有其固有的易变性 生物技术药物的质量控制 质量控制包括两个方面 1 生产过程中质量控制GMP 硬件 软件 2 最终目标产品的质量控制 方法学研究 质量控制方法学研究具体内容 一 结构鉴定和确证 二 生物学活性测定和比活性 三 蛋白质纯度检查 四 蛋白质含量测定 五 蛋白质药物理化性质的鉴定 六 残余杂质检查 一 鉴定 v采用适宜的技术鉴定生物技术原料药或制剂 的物理化学性质 生物活性 免疫化学性质 纯度
4、和杂质 1 氨基酸序列 v预期产品的氨基酸序列测定在很大程度上可 应用如 b e 款项中提到的测定方法 随后 与预期产品基因推导的氨基酸序列进行比较 2 氨基酸组成 v氨基酸组成是先用各种水解及微量氨基酸自 动分析仪测定 然后再与产品基因推导的氨 基酸组成进行对比 v在大部分情况下 氨基酸组成分析对多肽和 小分子蛋白质可提供某些有用的结构资料 但对大分子蛋白很难确定 v在大多数情况下 氨基酸定量分析也可用于 确定蛋白质含量 3 N末端和C末端氨基酸测序 v末端氨基酸序列分析是用以鉴别多肽或蛋白 质的氨基端和羧基端的性质及均一性 v作为重组蛋白质和肽的重要鉴别指标 一般 要求至少测定N 末端15
5、个氨基酸 C 末端1 3氨基酸 v如发现预期产品的氨基酸末端是异质的 应 用适宜分析方法测定变异体的相对含量 4 肽图 v用酶或化学物选择性地将产品切成片段 切 成的片段用HPLC SDS PAGE电泳法 质谱 法测定 v验证的方法测得的原料药或制剂的肽图 可 作为批检验中确证预期产品结构的方法 5 巯基和二硫键 v二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关 发生错误配对 不但活性降低而且会引起 抗原性增加 v根据预期产品基因序列推导出半肮氨酸残基 采用肽图制备 还原和不还原情况下 质谱 或其他适宜的技术 测定游离SH基和 或二硫 键的数目和位置 v评价用生物技术方法生产的糖蛋白时 应考 虑糖基化
6、位点的上调或下调及其对生物活性 代谢 稳定性 溶解性的影响 v每一种真核细胞具有其独特的糖基化能力称 为它的糖类型 通过基因工程方法将一种糖 蛋白在不同细胞中表达 可以导致生产不同 类型的糖蛋白 即使在相同的细胞类型中 也可能会出现糖形成时由于一些寡糖的精细 结构不同等而产生截然不同的糖蛋白 6 糖结构 v对于糖蛋白 要测定糖含量 中性糖 氨基糖 唾液酸 v另外 应尽可能分析多肽链的糖链结构 寡 糖类型 触角形状 和糖基化位点 二 生物学活性测定和比活性 1 意义 1 生物技术产品的化学本质为蛋白质 多肽 其活 性由产品的氨基酸序列或其空间结构所形成的活性中 心所决定的 与其绝对质量不一致 2
7、 生物技术产品的生物学活性与药效学基本相一致 3 利用生物学活性建立的测定效价体系 是给药品 定量的依据 保证产品药效的重要手段 v有效的效价测定是生物技术原料药和 或制剂 规范的组成部分 当原料药采用一种效价测 定方法时 其制剂可用另一种方法 物理化学 的和 或生物学的 测定 但应提供选择方法的 依据 效价测定一般原则 1 国际通用方法 2 测定结果须用国际或国家标准品校正 以 国际单位表示 生物学活性测定方法分类 1 体外细胞培养测定法 a 促进细胞生长作用 G CSF NFS 60 b 抑制细胞生长作用 TNF L929 c 间接保护细胞作用 IFN VISH VSV 2 离体动物器官测
8、定法 采用家兔主动脉条测定重组脑利钠肽生物活性 3 体内测定法 4 生化酶促反应测定法 5 免疫学活性测定法 利用动物体内某些指标变化 定出产 品的单位 如EPO活性测定 体内注射EPO后 计算小鼠网织红细胞增加的数量与标准品 比较 确定其活性单位 基于产品与某种物质的结合或产品本身 的化学反应为原理设计 具有简便 精确 稳定等特点 如重组链激酶 葡激酶生物活 性测定 链激酶 葡激酶和纤溶酶原 h plg 结合形成复合物激活游离h plg原为有活性 的纤溶酶 利用制品免疫原性 制备相应单克隆抗 体或多克隆抗体 采取 ELISA 法测定其含 量 生物学活性测定方法选择 体内测定和体外测定方法 a
9、 体内测定 即整体动物测定 能为较大 范围的重组产品的效价提供有用信息 但费时 昂贵 难操作及同时存在伦理问题 大多数 情况下倾向于选择体外测定方法 b 体外测定 可使用分离的器官或组织 原代细胞或传代细胞系 目前最常用方法是连 续生长 因子依赖的 克隆化的细胞系的方法 其测定结果比较准确 重现性好 经济 容 易使用和便于统计分析 生物学活性测定方法选择 2 定量 半定量 定性方法 a 通过研究首先选择能够定量评价的方法 最好的选择是背景较低的反应 并且对相关产 品有陡峭的 可重复的剂量 反应曲线 其次考 虑半定量方法 如NGF 最后考虑定性 如 BMP 方法 b 对生产工艺稳定 生物学活性测
10、定方法复 杂 可采用其他替代方法 如重组人生长激素 用HPLC定量方法代替复杂生物活性测定方法 细胞培养法中细胞染色标记方法 3H thymidine BrdU 是反映DNA合成 增殖细胞 数的比例的 BrdU 首先用BrdU做标记 固定细 胞 用核苷酸酶处理后使过氧化物酶结合抗BrdU抗 体发生反应 MTT 四氮唑盐 其在活细胞的线粒体中可以 定量地被琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶 物MTT formazan 二甲基亚砜 DMSO 和酸化的异丙 醇或酸化的SDS均能溶解紫色结晶物 通过比色法测 定MTT formazan的量可以反映线粒体电子传递系统 机能 间接表示细胞的生长状态 Al
11、amar Blue 氧化型Alamar Blue 600nm 可 被活细胞中的线粒体酶还原 还原后染料 570nm 发生颜色和荧光改变 颜色和荧光的深浅与活细胞数 成正比 可用分光光度计或荧光检测仪检测 Crystal violet 染活细胞后 在比色计中测 定光吸收值 A A值与着染色细胞数成正比 几种细胞培养测定方法比较 3H thymidine BrdU MTT Alamar Blue 靶向物 DNA合成系统 线粒体电子传递系统 检出细胞的状态 增殖 增殖 生存 检出法 放射活性 色素 荧光 色素 色素 荧光 抽出的必要性 其他试剂的必要性 成本 以MTT为1时 60 80 100 试剂
12、盒 1 2 缺点 使用同位素 不适合 检出大量未增殖 检出未增 浮游细胞 细胞 处理时费力 殖活细胞 生物学活性测定分析方法 1 用能诱导50 最大反应的待测样品最高稀释度作 为参考效价 或滴度 或以此稀释度中所含样品的 量为1单位 即以此稀释度的倒数为待测样品所含的 单位数 2 比较已知浓度或活性单位样品标准品和待测样 品的实验结果 活性标准 品 待测样品 稀释度 a b A值 生物学测定基本模式图 蛋白质药物的比活性测定的意义 1 比活性 每毫克蛋白质的生物学活性单位 2 蛋白质的空间结构不能常规测定 而它的改变 如二硫键的错误配对 可影响蛋白质的生物学活性 从而影响药效 比活性可以反映此
13、种情况 3 比活性可反映产品生产工艺的稳定情况 可比较 不同表达体系 不同生产厂家生产同一产品时的质量 情况 4 比活性是重组蛋白质药物不同于化学药的一项重 要指标 也是进行成品分装的重要定量依据 生物活性测定标准范围确定 1 使用验证过的测定和分析方法 并提供用 此方法的效价测定平均值和单测定一批误差的 可信限范围 2 对于成品的生物活性测定标准 要根据不 同方法的特点规定相当标示量的范围 目前 生物活性的测定方法有四类 动物基础 细胞 基础 生化 酶 法 特异 免疫 受体 结 合法 不同生物活性测定方法的规定标准表 测定方法 规定标准 动物基础的生物活性测定 70 130 标示量 细胞基础
14、的生物活性测定 80 120 标示量 体外酶法的生物活性测定 85 115 标示量 受体结合的生物活性测定 85 115 标示量 生物学活性效价测定过程中 标准品的作用 1 生物学活性测定变异范围大 同样制品在不同实 验室测定结果差异很大 必须有一个统一的标准 2 标准品的使用 最大限度地减少实验室之间和各 种影响测定因素地干扰 物理化学方法取代生物方法的条件 p 产品的物理化学方法数据较完善 并已证实其高级 结构 p 物理化学与生物试验之间的关系亦已阐明 p 工厂已积累了足够数据 可用物理方法取代 p 当产品仅用物理化学方法表示生物活性 结果应用 重量表示 p 产品出厂检定 工厂可合理选择定
15、量方法 生物 测定还是物理化学鉴定 三 蛋白质纯度检查 v生物技术原料药和制剂的绝对纯度难以测得 并且所得结果与所用方法有关 v原料药和制剂的纯度一般是用几种方法合并 估计的 v分析方法的选择和优化主要应考虑的因素是 预期产品与产品相关物质和产品杂质的分离 v由于生物技术产品及生物制品的分子特征和独特的 生物合成过程 产品可含有几种分子实体或变异体 如这些分子实体来源于所预期的翻译后修饰品 则应作为预期产品的一部分 v预期产品在生产和 或储存过程中形成的变异体 如 其性质与预期产品相似 应作为产品相关物质 而 不是杂质 v对于批检验 只需选用一部分适用的方法并阐明其 纯度测定的合理性 v按WH
16、O规定必须用HPLC和非还原SDS PAGE两种 方法测定 其纯度都应达到95 以上 有的 甚至要求达到99 以上 v纯度的检查通常是在原液中进行 v方法 非还原SDS PAGE电泳法 HPLC法 毛 细管电泳 1 非还原SDS PAGE电泳法 1 银染加样量 5ug 1 10ng 2 考马斯亮蓝R 250 加样量 10ug 100ng 结 果 无明显杂蛋白带出现 目标蛋白 量应不低于总蛋白量的95 或98 蛋白质样 品在荷质比均一 2 HPLC法 分子筛 反相层析 离子交 换层析 尽量采用与SDS PAGE原理不同的反 相或离子交换层析 不主张用分子筛分析 3 毛细管电泳 简便 快速 灵敏度和 分辨率高 价格高 重现性差 几种检定重组蛋白纯度方法的比较 特性 HPLC SDS PAGE IEF CE 分离机制 极性 非极性分配 电荷 等电点 电荷等 分子大小 离子交换 分析所需时间 10 120min 几小时 10 30min 分辨力 好 好 好 样品体积 10 50ul 1 50ul 1 50nl 灵敏度范围 ng ug ng ug pg 定量准确性 分析方式 紫外 荧光 折射 紫
