基因工程第二节

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1、429572439gao 1 2基因工程的基本操作程序 必修复习 选修新课 1 提取目的基因2 与运载体结合3 导入受体细胞4 目的基因表达与检测 1 获取目的基因2 构建表达载体3 导入受体细胞4 目的基因检测与鉴定 四个步骤 429572439gao 1 2基因工程的基本操作程序 必修复习 选修新课 1 获取目的基因2 构建表达载体3 导入受体细胞4 目的基因检测与鉴定 四个步骤 为什么要进行 429572439gao 现代基因阶段 基因的定义基因是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列 是遗传物质的最小功能单位 基因的分类将编码蛋白质的基因根据其是否具有转录和翻译功能可以把基因分为

2、三类 具有转录和翻译功能 只有转录功能而没有翻译功能的基因 包括tRNA基因和rRNA基因 不转录的基因 它对基因表达起调节控制作用 包括启动基因和操纵基因 什么是基因 中学阶段理解 基因是有遗传效应的DNA片断 是决定生物性状的基本单位 每个DNA分子上有很多个基因 每个基因可以含有成百上千个脱氧核苷酸 不同基因中脱氧核苷酸的排列顺序不同 因此不同的基因含有不同的遗传信息 429572439gao DNA RNA RNA 蛋白质 基因的表达 429572439gao 正品beely奇七效合一bb霜50g完美裸妆保湿遮瑕购买地址 429572439gao 为什么同一个体 胰岛细胞能合成胰岛素

3、而口腔上皮细胞却不能 是否基因组成是不同的 429572439gao 原核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 编码区上游 编码区下游 不能编码蛋白质可调控遗传信息的表达 调控序列 429572439gao 原核细胞的基因结构 与RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶是由多个肽链构成的蛋白质 能识别并与调控序列中的结合位点结合 催化转录形成RNA 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚酶结合位点 RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点 并与其结合 转录开始后 RNA聚合酶沿DNA分子移动 并与DNA分子的一条链为模板合成RNA 转录完毕后 RNA链释放出来 紧接着R

4、NA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来 429572439gao 与RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶 RNA聚合酶 RNA聚合酶 知识构建1 原核细胞的基因结构 结构 功能 编码区 能转录并蛋白质 编码区上游 编码区下游 非编码区 是 起作用 终止转录mRNA 终止子 调控的表达 mRNA 编码 RNA聚合酶结合位点 起动并催化转录 遗传信息 429572439gao 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 编码区下游 调控遗传信息的表达 调控序列 外显子 能编码蛋白质 内含子 不能编码蛋白质 转录 mRNA前体 成熟mRNA 知识构建2 真核细胞的基因结构 结构 编码区 非编码区 内

5、含子 外显子 能够 并序列 能够 不能序列 1 编码区是 的 2 在不同的基因中所含的和数目不同 3 编码区占的比例小 大部分由组成 特点 有序列 功能 转录RNA 编码蛋白质 转录RNA 编码蛋白质 间隔的 不连续 外显子 内含子 外显子 内含子 调控遗传信息的核苷酸 429572439gao 原核细胞基因与真核细胞基因的比较 都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成 编码区是连续的 编码区是间隔的 是不连续的 429572439gao 原核生物基因表达的调控 乳糖代谢基因表达调控图解 没有乳糖时 lacZ lacY lacA 调节基因 启动子 操纵基因 结构基因 RNA聚合

6、酶 信使RNA 转录 翻译 阻抑物与操纵基因结合 结构基因转录受阻 阻抑物 429572439gao 原核生物基因表达的调控 乳糖代谢基因表达调控图解 有乳糖时 lacZ lacY lacA 调节基因 启动子 操纵基因 结构基因 RNA聚合酶 信使RNA 转录 翻译 阻抑物与乳糖结合后构象发生了改变 因而不能与操纵基因结合 使得结构基因进行转录 阻抑物 乳糖 转录 半乳糖苷酶 酶 酶 429572439gao 目的基因获取方法 第一步 获取目的基因 主要指编码蛋白质的结构基因 也可以是调控因子 方法 基因的直接分离或人工合成 结果 获取含有所需要的完整的遗传信息的DNA片段 1 从基因文库中获

7、取2 利用PCR技术扩增 429572439gao 基因库 genepool 特定生物体全基因组的集合 天然存在 基因组文库 包含一种生物所有的基因 cDNA文库 只含部分基因 根据构建方法的不同 基因文库分为 1 从基因文库中获取 基因文库 genelibraryorgenebank 从特定生物个体中分离的全部基因 这些基因以克隆的形式存在 人工构建 429572439gao 基因组文库 cDNA文库 429572439gao 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 克隆载体 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体 表达载

8、体 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体 1 从基因组文库获取目的基因 429572439gao mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 2 从cDNA文库获取目的基因 429572439gao 图为由mRNA反转录形成cDNA的过程 429572439gao 基因组文库和cDNA文库的主要区别 429572439gao 2 利用PCR技术扩增 聚合酶链式反应 变性 复性 退火 延伸 氢键打开 形成模板链 引物与DNA互补配对 DNA聚合酶作用使引物延伸 429572439gao 1 2 3 4 脱氧核苷酸 DNA聚合

9、酶 引物 人工合成的 与模板DNA上所要扩增的DNA片段的两侧序列互补 长度为20 25碱基的寡核苷酸单链 429572439gao PCR原理 DNA双链复制 特点 1 体外复制2 大量获取目的基因 指数式增长 3 原理和操作简单 429572439gao 3 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 根据蛋白质的氨基酸顺序推算出mRNA核苷酸顺序 再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序 用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因 DNA合成仪 429572439gao 第二步 基因表达载体的构建 使目的基因能稳定遗传 表达发挥作用 启动子 一段特殊结构的DNA片段 位于基因首端

10、 是RNA聚合酶识别和结合的部位 终止子 使转录停止 标记基因 鉴定受体细胞是否含有目的基因 进行细胞筛选 是指已知功能或已知座位的基因 在基因工程中使用与选择重组体DNA转化细胞的基因 在基因定位中是指定位在染色体或其它载体上的基因以作为其它基因定位的标记 429572439gao 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命 动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能 采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移 可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率 同时 采用转基因体细胞系 可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选 在核移植前 先把目的外源基因和标记

11、基因 如LagZ基因和新霉素抗生基因 的融合基因导入培养的体细胞中 再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆 然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中 最后生产出的动物在理论上应是100 的阳性转基因动物 采用此法 Schnieke等 BioReport 1997 已成功获得6只转基因绵羊 其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因 新霉素抗性基因 3只带有标记基因 目的外源基因整合率高达50 Cibelli Science 1997 同样利用核移植法获得3头转基因牛 证实了该法的有效性 由此可以看出 当今动物克隆技术最重要的应用方向之一 就是高附加值转基因克隆动物的研究开发 42957

12、2439gao 429572439gao 人工接头及其应用 429572439gao 第三步 导入受体细胞 导入方式 转化 transformation 转染 transfection 感染 infection 转化 目的基因进入受体细胞内 并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程 将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞 并使其获得新的表型的过程 感染 以 噬菌体 粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子 在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒 感染适当的细胞并在细胞内扩增 转染 真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程 429572439gao 转化的方法

13、 导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞 受体细胞应具备的条件 1 限制性缺陷型 外切酶和内切酶活性缺陷 recB recC hsdR 2 重组整合缺陷型 用于基因扩增或高效表达的受体细胞 recA 3 具有较高的转化效率4 具有与载体选择标记互补的表型5 感染寄生缺陷型 防止重组细菌扩散污染 生物武器除外 429572439gao 1 导入植物细胞 农杆菌转化法 特点 易感染双子叶植物和裸子植物 可把Ti质粒上的T DNA转移到受体细胞 并整合到受体细胞染色体的DNA上 429572439gao 429572439gao 2 导入动物细胞 显微注射技术 用口径为1 m的DNA注射器 将大

14、量的目的基因片段注入到受精卵的核内 然后把经过注射的受精卵移植到另一雌性动物的子宫内 使受精卵发育为转基因动物 429572439gao 429572439gao 原核生物的特点 繁殖快 单细胞 遗传物质少 2 导入微生物细胞 大肠杆菌转化过程 将细菌用CaCl2处理 以增大细菌细胞壁的通透性 使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞 目的基因在受体细胞内 随其繁殖而复制 由于细菌繁殖的速度非常快 在很短的时间内就能获得大量的目的基因 429572439gao 常用的受体细胞 大肠杆菌 枯草杆菌 农杆菌 酵母菌和动植物细胞等 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径 429572

15、439gao 第四步 目的基因的检测与鉴定 DNA分子杂交技术 429572439gao 探针 probe 一小段用同位素 生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸 与固定在膜上的核苷酸结合 判断是否有同源的核酸分子存在 标记物同位素标记 32P非放射性标记 荧光标记 生物素 dig 地高辛 等 429572439gao 1 检测转基因生物的染色体DNA上的目的基因2 检测目的基因是否转录mRNA3 检测目的基因是否翻译蛋白质 检测 鉴定 个体生物学水平鉴定 如抗虫 抗病鉴定 基因工程产品与天然产品功能进行活性比较等 429572439gao 大量的受体细胞接受不多的目的基因 处

16、理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少 必须将它从中检测出来 将每个受体细胞单独培养形成菌落 检测菌落中是否有目的基因的表达产物 淘汰无表达产物的菌落 保留有表达产物的进一步培养 研究 429572439gao 基因工程的操作过程 切 接 转 增 检 429572439gao 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小结 以质粒为载体的DNA克隆过程 429572439gao 克隆 clone 通过无性繁殖获得来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合 而获取此同一拷贝的过程称为克隆化 cloning DNA克隆 技术水平 分子克隆 molecularclone 即DNA克隆细胞克隆个体克隆 动物或植物 429572439gao DNA克隆应用酶学的方法 在体外将各种来源的遗传物质 同源的或异源的 原核的或真核的 天然的或人工的DNA 与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子 复制子 replicon 继而通过转化或转染宿主细胞 筛选出含有目的基因的转化子细胞 再进行扩增提取获得大量同一DNA分子 也称基因克隆或重组DNA recombinantDNA 429572439gao Trans