《产青霉素酶菌种分离》由会员分享，可在线阅读，更多相关《产青霉素酶菌种分离（16页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、产青霉素酶菌种的分离 纯化及活性测定 目录 实验原理实验内容实验结果讨论 实验原理 青霉素酶又称 内酰胺酶 lactamase EC3 5 2 6 可水解 内酰胺类抗生素 利用青霉素酶具有水解 内酰胺类抗生素的特点 可将其用于抗菌药物筛选 枯草芽孢杆菌是常见的青霉素酶分泌菌种 革兰氏阳性菌 属芽孢杆菌 无荚膜 周生鞭毛 能运动 芽孢呈椭圆到柱状 位于菌体中央或稍偏 菌落表面粗糙不透明 污白色或微黄色 在液体培养基中生长时 常形成皱醭 实验原理 紫外线作为物理诱变因子对诱变最有效的波长是在253 265nm 紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA变化而造成的 DNA对紫外线有强烈的吸收作用 尤其
2、是碱基中的嘧啶 它比嘌呤更为敏感 在进行酶活力诱导时 采用剩余碘量法测定 以标准对照法计算含量 青霉素在碱性条件下水解 生成的青霉噻唑酸在酸性条件下与定量过量的碘作用 剩余的碘用硫代硫酸钠滴定 同时做空白试验 实验内容 一 从土壤中分离菌种1 青霉素溶液的制备 称取0 625g160万单位 0 96g青霉素溶解于10ml生理盐水中 即得10万单位 ml的青霉素 2 采集一个土壤样品 约取10g 75 水浴加热20min 取1ml上层液稀释1000倍 取1ml上层液到100ml 1000 2000 5000单位 液体培养基 封口摇床培养 即为实验所用菌液 3 取菌液分别接种到1000单位 200
3、0单位 5000单位的培养基 37 培养24h 5 取5000单位的菌 按照上述方法诱导至1万单位 实验内容 二 筛选菌种1 挑取干燥的菌落 5000单位 进行革兰氏染色 镜检 将形状为杆状的菌落标上记号 1 涂片 2 晒干 3 固定 4 染色 5 水洗 6 干燥 7 镜检2 将筛选出的菌种保存到斜面培养基 4 实验内容 三 酶活力的测定1 取菌体平板培养物 接种至发酵培养基内 在25 摇床培养24小时 取摇瓶培养基中菌液15ml 4000r min离心15min 沉淀菌体 取上清液保存 2 称取青霉素钠 钾 适量 用磷酸盐缓冲液 pH7 0 溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液 另取粗酶溶
4、液 按估计单位用磷酸盐缓冲液 pH7 0 稀释1000倍 在37 预热 实验内容 3 精密量取青霉素溶液50ml 置100ml量瓶中 预热至37 后 精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml 迅速混匀 在37 准确放置1小时 精密量取3ml 立即加至已精密量取的碘滴定液 0 01mol L 25ml中 在室温暗处放置15分钟 用硫代硫酸钠滴定液 0 01mol L 滴定 至近终点时 加淀粉指示液 继续滴定至颜色消失 4 取已预热的青霉素溶液2ml 在37 放置1小时 精密加入上述碘滴定液 0 01mol L 25ml 然后精密加粗酶稀释液1ml 在室温暗处放置15分钟 用硫代硫酸钠滴定液 0 0
5、1mol L 滴定 得空白滴定消耗 实验内容 按下式计算 E B A M F D 100式中E为青霉素酶活力 单位 ml 小时 B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量 ml A为样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量 ml M为硫代硫酸钠滴定液的浓度 mol L F为在相同条件下 每1ml的上述碘滴定液 0 01mol L相当于青霉素的效价单位 742 D为青霉素酶溶液的稀释倍数 实验内容 四 诱变育种1 将之前保种的10000单位的菌种接种在250ml液体培养基里面摇床培养18h 2 将试管里的菌液稀释到100万单位 ml 3 将稀释后的菌液平铺 约取3ml 在6个灭菌的空平板上
6、 分别于紫外灯下照射0min 1min 3min 5min 7min 9min 4 取照射后的菌液分别涂布在含有青霉素10000单位 ml 15000单位 ml的固体培养基上 于37 培养箱保存 之后观察菌落生长情况 5 挑取长出来的菌落在液体培养基里面培养48h 取培养液进行测酶活 得出结论 实验结果 一 从土壤中分离菌种 5000单位 1000 10000单位 实验结果 二 镜检 实验结果 三 酶活测定结果结果数据记录 稀释100倍滴定刻度变化A样品1 7 3 5mL1 8mlB空白2 0 4 1mL2 1ml硫代硫酸钠滴定液浓度0 01mol L碘滴定液浓度0 05mol L计算 E B
7、 A M F D 100 2 1 1 8 0 01 742 100 100 22260单位 实验结果 四 紫外诱变结果第一次做的诱变育种没有长出菌落 因此重复了诱导步骤 培养48h后仅长出5min平板其余均未长菌 总结 1 实验过程中尝试很多菌株的诱变方法 平板筛选不成功后及时改进方案 改为液体培养基梯度培养 我们最终得到了耐10000 青霉素的菌株 经过镜检发现该菌株确实是杆菌 对此菌株进行了保存 2 在酶活力测定过程中 按药典配制的滴定液浓度经滴定测定不准确 原因可能是没有及时将硫代硫酸钠避光保存 因而最终结果酶活力偏小 3 第一次紫外诱变后所有平板包括对照均没有长菌 对菌株进行了第二次10000单位诱导发现其确实为所需要的菌株 于是进行了第二次诱导 第二次诱导12h未长菌 48h后有些平板长了霉菌影响观测 仅能看到紫外照射五分钟平板长菌 但无法确定是否为所需菌株 致谢 非常感谢实验过程中老师的支持和帮助 使我们的实验能够正常完成 并且有一定效果 同时感谢本组成员的积极参与支持 2016年5月26日
