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1、 .抗生素发酵生产工艺1. 青霉素发酵工艺的建立对抗生素工业有何意义?青霉素是发现最早,最卓越的一种B-内酰胺类抗生素,它是抗生素工业的首要产品,青霉素是各种半合成抗生素的原料。青霉素的缺点是对酸不稳定,不能口服,排泄快,对革兰氏阴性菌无效。青霉素经过扩环后,形成头孢菌素母核,成为半合成头孢菌素的原料。2. 如何根据青霉素生产菌特性进行发酵过程控制?青霉素在深层培养条件下,经历7个不同的时期,每个时期有其菌体形态特性,在规定时间取样,通过显镜检查这些形态变化,用于工程控制。第一期:分生孢子萌发,形成芽管,原生质未分化,具有小泡。第二期:菌丝繁殖,原生质体具有嗜碱性,类脂肪小颗粒。第三期:形成脂
2、肪包含体,积累储蓄物,没有空洞,嗜碱性很强。第四期:脂肪包含体形成小滴并减少,中小空泡,原生质体嗜碱性减弱,开始产生抗生素。第五期:形成大空泡,有中性染色大颗粒,菌丝呈桶状。脂肪包含体消失,青霉素产量提高。第六期:出现个别自溶细胞,细胞内无颗粒,仍然桶状,释放游离氨,pH上升。第七期:菌丝完全自溶,仅有空细胞壁。一到四期为菌丝生长期,三期的菌体适宜为种子。四到五期为生产期,生产能力最强,通过工艺措施,延长此期,获得高产。在第六期到来之前发束发酵。3. 青霉素发酵工程的控制原理及其关键点是什么?控制原理:发酵过程需连续流加葡萄糖,硫酸铵以及前提物质苯乙酸盐,补糖率是最关键的控制指标,不同时期分段
3、控制。在青霉素的生产中,及时调节各个因素减少对产量的影响,如培养基,补充碳源,氮源,无机盐流加控制,添加前体等;控制适宜的温度和ph,菌体浓度。最后要注意消沫,影响呼吸代谢。4. 青霉素提炼工艺中采用了哪些单元操作? 青霉素不稳定,发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速,防止降解。提炼工艺包括如下单元操作:预处理与过滤:在于浓缩青霉素,除去大部分杂质,改变发酵液的流变学特征,便于后续的分离纯化过程。萃取:其原理是青霉素游离酸易溶于有机溶剂,而青霉素易溶于水。脱色:萃取液中添加活性炭,除去色素,热源,过滤,除去活性炭。结晶:青霉素钾盐在乙酸丁酯中溶解度很小,在乙酸丁酯萃取液中加入乙酸钾-乙
4、醇溶液,青霉素钾盐可直接结晶析出。氨基酸发酵工艺1. 如何对谷氨酸发酵工艺过程进行调控?发酵过程流加铵盐、尿素、氨水等氮源,补充NH4+;生物素适量控制在2-5g/L;pH控制在中性或微碱性;供氧充足;磷酸盐适量。2. 氨基酸生产菌有什么特性,为什么?L-谷氨酸发酵微生物的优良菌株多在棒状杆菌属、小短杆菌属、节杆菌属和短杆菌属中。具有下述共同特性:细胞形态为短杆至棒状;无鞭毛,不运动;不形成芽孢;革兰氏阳性;生物素缺陷型;三羧酸循环、戊糖磷酸途径突变;在通气培养条件下产生大量L-谷氨酸。3. 生物素在谷氨酸发酵过程中的作用是什么?生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。生物素缺陷
5、型菌种因不能合成生物素,从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。因此,磷脂的合成量也相应减少,这就会导致细胞膜结构不完整,提高细胞膜对谷氨酸的通透性,解除其对谷氨酸脱氢酶的抑制,源源不断生产谷氨酸。维生素发酵生产工艺1. 比较分析现行维生素C的两种生产工艺过程及本质区别,有什么优势?现行的维生素c生产工艺过程有:莱氏化学合成法和两步发酵法。莱氏化学合成法:D-葡萄糖为原料,进过催化氢化生成D-山梨醇,然后生物氧化转变为L-山梨糖,酸性液中丙酮化,对-二仲醇进行保护。L-山梨糖高锰酸钾在碱性溶液中氧化为二丙酮-2-酮-L-古龙酸,除去丙酮,内酯化和烯醇化得到L-抗坏血酸
6、。整个合成过程必须保持第4位碳原子的构型不变。两部发酵法:催化氢化:催化氢化D-葡萄糖,控制压力,在氢做还原剂、镍做催化剂的条件下,将醛基还原成醇基,从而制备D-山梨醇。第一部发酵:D-山梨醇C2位羟基氧化为羰基,其他基团不变,微生物转化得L-山梨糖。第二部发酵:L-山梨糖到2-酮基-L-古龙酸需要将C1位醇基氧化为羧基,保持其他基团不发生变化。其中两步发酵法更具有优势。原因如下:以生物氧化代替化学氧化简化了生产工艺。省略了丙酮化反应步骤,节省了丙酮、硫酸等大量化工原料和其防爆设备,节约了成本,有利于安全生产。三废和污染较小。提高了生产能力。2.维生素C的生产工艺中,手性中心是如何实现的?维生
7、素C分子中含有两个手性碳原子,故有四个光学异构体。其中L(+)-抗坏血酸括性最高,D(-)-异抗坏血酸活性仅为其20,工业上将其作为食品抗氧剂。D(-)-抗坏血酸和L(+)-异抗坏血酸几乎无活性。3. 在未来,一步发酵能取代两部发酵,成为维生素生产的主流工艺吗,为什么?一步法发酵对工业菌株的山梨醇/糖旁路代谢途径进行敲除。与原始菌株比较,发现单菌发酵24h后,培养基中剩余的山梨醇糖含量基本保持恒定,NSR缺失株相对于原始菌株残糖量提高了85.9%。基因工程制药工艺1. 工程菌与宿主菌对培养基要求有何不同,为什么?碳源:大肠杆菌以蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源;酵母利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质
8、为碳源。氮源:不同工程菌对氮源利用能力差异大,具有很高的选择性。大肠杆菌利用酵母粉等大分子有机氮源;酵母利用氨基酸为氮源。选择剂:基因工程大肠杆菌含有抗生素抗性基因,抗生素作为选择剂;基因工程酵母菌常用氨基酸营养缺陷型。2. 影响工程菌培养工艺的主要参数是什么?如何优化控制?温度:生长与生产温度不一致。较高温度表达量大,易形成包涵体。策略:较低温度下有利于表达可溶性蛋白质。对于热敏感的蛋白质,高温会降解破坏。策略:生产期可采用先高温,然后低温,变温表达,避免蛋白质降解。pH:了解发酵过程中各个阶段的适宜pH以后,进一步设法控制pH在合适的范围内。 分阶段控制pH:根据试验结果来确定生长最适pH
9、和产物最适pH,以达到最佳生产。 溶解氧:从供应量和需要量(菌体生长、质粒稳定性、产物积累)二个方面考虑,使之需氧不超过设备的供氧能力,在临界溶解氧浓度之上。3. 诱导物对生长和产物合成有何影响,为什么?诱导物用来诱导表达型工程菌。在细胞生长到一定阶段,必需添加诱导物,以解除目标基因的抑制状态,活化基因,进行转录和翻译,生成产物。适宜的诱导时间非常重要。诱导物的浓度及其发酵温度会影响表达量和产物存在形式。化学诱导型启动子:lzc、tac、T7等,诱导时间为对数生长期。温度诱导型启动子:PL、PR等,诱导时间为对数期或稍后一些。基因工程制药工艺1. 什么是基因工程菌,工程菌构建的基本过程和各阶段
10、的主要任务是什么,所涉及基因工程原理是什么?将目的基因导入细菌体内使其表达,产生所需要的蛋白的细菌称为基因工程菌。工程菌构建的基本过程如下:目标基因克隆(PCR、文库筛选、化学合成)表达载体构建(酶切、链接)遗传转化与筛选(外源基因导入与培养)工程菌(获得新形状、功能、产生物质)酶切:在特异位点上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性片段。(DNA+缓冲液+限制性内切酶;37,1小时;加热、加EDTA终止;电泳检查酶切完整性)链接:DNA双链上相邻的3羟基和5磷酸基团共价结合形成3-5磷酸二酯键,使原来断开的DNA缺口重新连接起来。(载体片段和基因片段,缓冲液,连接酶;16-26,数小时;
11、70加热10min终止反应)转化:把外源基因导入宿主细胞的过程。(氯化钙法向大肠杆菌导入外源基因)2. 目标基因克隆的主要方法有哪些?分析其特点及其适用范围PCR扩增。优点:简便快速,高效,数kb单基因克隆。缺点:DNA聚合酶活性和保真性限制。(94变性55退火72延伸94变性)文库筛选。优点:长片段,无碱基错误,位置序列基因克隆。缺点:繁琐,过程复杂,耗时,昂贵。化学合成:简便,准确,已知序列基因克隆,引物合成。缺点:受合成仪性能限制,长度很短。3. 大肠杆菌中高效表达蛋白药物着重设计哪几个方面?为了确保工程菌构建的有效性,必须遵循GMP及其有关生物制品研究技术指导原则,做好菌种的记录和管理
12、。表达载体,详细记录表达载体,包括基因的来源、克隆和鉴定,表达载体的构建、结构和遗传特性。宿主细胞:详细记录宿主细胞的资料,包括细胞株系名称、来源、传代历史、鉴定结果及基本生物学特性等。目标基因序列:目标基因的序列包括插入基因和表达载体两端控制区的核苷酸序列,以及所有与表达有关的序列,做到序列清楚。重组人干扰素生产工艺1. 重组人干扰素生产工艺路线有哪几条,有何缺点?体外诱生干扰素制备工艺:仙台病毒诱导人白细胞:血浆人白细胞(病毒诱导)分离纯化人白干扰素。缺点:产量低,1g IFN需要105L人血白细胞,来源困难,工艺复杂,收率低,价格昂贵,潜在的血源性病毒污染的可能性。Namalva细胞培养
13、(病毒培养)合成干扰素分离纯化多压型混合干扰素。优点:首次实现大规模商业化生产,用细胞培养8000L。缺点:活性低,退出临床应用。工程菌构建发酵培养包涵体复性重组人干扰素。工艺特点:发酵过程,随后变性、复性过程。缺点:生物合成、纯化及制剂阶段均使用了一些动物或人血液提取成分,仍然没有摆脱潜在的传播血源性疾病的危险。工程细胞系构建细胞培养收集培养液分离纯化重组人干扰素。工艺特点:分泌表达,产量低,成本高,过程控制严格。可以做到无血清培养。 基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺。工艺特点:发酵周期短:几个小时,无需变性、复性过程,获得有活性产品,纯化过程:淘汰抗体亲和层析,制剂中采用非人血清白蛋白新型保
14、护剂,使得整个制造过程中不使用任何血液提取成分。2. 重组人干扰素发酵工段的关键控制点是什么,如何实现最优化过程控制?摇瓶培养:摇瓶培养:30,pH7.0,250rpm,16-20h;种子罐培养:接种:接入50L种子罐,接种量10%培养:30,pH7.0控制:级联调节通气量和搅拌转速。3. 干扰素纯化工艺的原理是什么?基于蛋白质的电荷性除去杂质,准确控制缓冲液和上样液的pH及电导值,纯化干扰素4. 干扰素纯化工艺过程中各工段的目的是什么? 溶解粗干扰素:配置缓冲液(超纯水,pH7.5磷酸缓冲液,0.45m滤器和10ku超滤系统,百级层流下收集),冷却至2-10。在均浆器中完全溶解粗干扰素。 等
15、点沉淀与疏水层析:磷酸调节至pH5.0,沉淀杂蛋白,离心收集上清液(含有人干扰素)。用NaOH调节上清液pH7.0,并用5M NaCl调节溶液电导值180ms/cm,上样,进行疏水层析,利用干扰素的疏水性进行吸附。在2-10下,用0.025M磷酸缓冲液(pH7.0)+1.6M NaCl进行洗涤,除去非疏水性蛋白。用0.01M磷酸缓冲液(pH8.0)进行洗脱,收集洗脱液,干扰素。 或等电点沉淀与盐析:磷酸调节pH4.5,调节电导值40 ms/cm,2-10静置过夜,除杂蛋白。1000ku超滤膜过滤,除去大蛋白。调整溶液pH8.0,10ku超滤膜,0.005M缓冲液。 阴离子交换层析与浓缩:0.01M磷酸缓冲液(pH8.0)平衡树脂,盐浓度线性梯度550ms/cm进行洗脱,2-10,配合SDS-PAGE收集干扰素峰。把目标馏分合并,调整溶液pH和电导值,10ku超滤膜,0.05M醋酸缓冲液(5.0)中透析。 阳离子交换层析与浓缩:用0.1M醋酸缓冲液(pH0.5)平衡树脂。上样,相同缓冲液冲洗。盐浓度线性梯度5-50ms/cm进行洗脱,配合SDS-PAGE收集干扰素峰。合并馏分,10ku超滤膜系统。 凝胶过滤层析:0.15M NaCl的0.01