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1、DNA的生物合成 复制 DNABiosynthesis Replication 第十章 复制 replication 是指遗传物质的传代 以母链DNA为模板合成子链DNA的过程 复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication 第一节 复制的方式 半保留复制 semi conservativereplication 复制的高保真性 highfidelity 双向复制 bidirectionalreplication 半不连续复制 semi discontinuousreplication 一 半保留复制的实验依据和意义 DNA生物合成时 母链DNA解开为两股单链 各自作为模板
2、 template 按碱基配对规律 合成与模板互补的子链 子代细胞的DNA 一股单链从亲代完整地接受过来 另一股单链则完全从新合成 两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致 这种复制方式称为半保留复制 半保留复制的概念 AGGTACTGCCACTGG TCCATGACGGTGACC CCACTGG GGTGACC AGGTACTG TCCATGAC TCCATGAC AGGTACTG AGGTACTGCCACTGG TCCATGACGGTGACC AGGTACTGCCACTGG TCCATGACGGTGACC 母链DNA 复制过程中形成的复制叉 子代DNA 目录 子链继承母链遗传信息的几种
3、可能方式 全保留式半保留式混合式 密度梯度实验 实验结果支持半保留复制的设想 含重氮 DNA的细菌 第一代 第二代 梯度离心结果 按半保留复制方式 子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致 即子代保留了亲代的全部遗传信息 体现了遗传的保守性 半保留复制的意义 遗传的保守性 是物种稳定性的分子基础 但不是绝对的 原核生物复制时 DNA从起始点 origin 向两个方向解链 形成两个延伸方向相反的复制叉 称为双向复制 二 双向复制 A 环状双链DNA及复制起始点B 复制中的两个复制叉C 复制接近终止点 termination ter 真核生物每个染色体有多个起始点 是多复制子的复制 习惯上把两个相邻起
4、始点之间的距离定为一个复制子 replicon 复制子是独立完成复制的功能单位 三 复制的半不连续性 领头链 leadingstrand 随从链 laggingstrand 顺着解链方向生成的子链 复制是连续进行的 这股链称为领头链 另一股链因为复制的方向与解链方向相反 不能顺着解链方向连续延长 这股不连续复制的链称为随从链 复制中的不连续片段称为岡崎片段 okazakifragment 领头链连续复制而随从链不连续复制 就是复制的半不连续性 DNA复制的酶学TheEnzymologyofDNAReplication 第二节 参与DNA复制的物质 底物 substrate dATP dGTP
5、dCTP dTTP聚合酶 polymerase 依赖DNA的DNA聚合酶 简写为DNA pol模板 template 解开成单链的DNA母链引物 primer 提供3 OH末端使dNTP可以依次聚合其他的酶和蛋白质因子 一 复制的化学反应 dNMP n dNTP dNMP n 1 PPi 目录 聚合反应的特点 DNA新链生成需引物和模板 新链的延长只可沿5 3 方向进行 二 DNA聚合酶 全称 依赖DNA的DNA聚合酶 DNA dependentDNApolymerase 简称 DNA pol 活性 1 5 3 的聚合活性2 核酸外切酶活性 3 5 外切酶活性 5 3 外切酶活性 能切除突变的
6、DNA片段 能辨认错配的碱基对 并将其水解 核酸外切酶活性 目录 一 原核生物的DNA聚合酶 DNA pol DNA pol DNA pol 一 原核生物的DNA聚合酶 功能 对复制中的错误进行校读 对复制和修复中出现的空隙进行填补 DNA pol 109kD 323个氨基酸 小片段 5 核酸外切酶活性 大片段 Klenow片段 604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 N端 C端 DNA pol Klenow片段是实验室合成DNA 进行分子生物学研究中常用的工具酶 DNA pol 120kD DNA polII基因发生突变 细菌依然能存活 它参与DNA损伤的应急状态修复 功能是原
7、核生物复制延长中真正起催化作用的酶 DNA pol 250kD 二 真核生物的DNA聚合酶 DNA pol 起始引发 有引物酶活性 延长子链的主要酶 有解螺旋酶活性 参与低保真度的复制 在复制过程中起校读 修复和填补缺口的作用 在线粒体DNA复制中起催化作用 DNA pol DNA pol DNA pol DNA pol 二 真核生物的DNA聚合酶 三 复制保真性的酶学依据 复制按照碱基配对规律进行 是遗传信息能准确传代的基本原理 复制保真性的酶学机制 一 DNA pol的核酸外切酶活性和及时校读 二 复制的保真性和碱基选择 一 DNA pol的核酸外切酶活性和及时校读 A DNA pol的外
8、切酶活性切除错配碱基 并用其聚合活性掺入正确配对的底物 B 碱基配对正确 DNA pol不表现活性 二 复制的保真性和碱基选择 DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价 氢键 与共价 磷酸二酯键 键的有序形成 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型 与相应的嘧啶形成氢键配对 嘌呤应处于反式构型 1 遵守严格的碱基配对规律 2 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能 3 复制出错时DNA pol的及时校读功能 DNA复制的保真性至少要依赖三种机制 四 复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部 只有把DNA解成单链 它才能起模板作用 一 解螺旋酶 引物酶和单链DNA结合蛋白 E
9、Coli基因图 解螺旋酶 helicase 利用ATP供能 作用于氢键 使DNA双链解开成为两条单链引物酶 primase 复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白 singlestrandedDNAbindingprotein SSB 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整 二 DNA拓扑异构酶 DNAtopoisomerase 解链过程中正超螺旋的形成 目录 拓扑异构酶作用特点既能水解 又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶 拓扑异构酶 分类 拓扑异构酶 切断DNA双链中一股链 使DNA解链旋转不致打结 适当时候封闭切口 DNA变为松弛状态 反应不需ATP 拓扑异构酶 切断DNA分
10、子两股链 断端通过切口旋转使超螺旋松弛 利用ATP供能 连接断端 DNA分子进入负超螺旋状态 作用机制 目录 五 DNA连接酶 连接DNA链3 OH末端和相邻DNA链5 P末端 使二者生成磷酸二酯键 从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链 DNA连接酶 DNAligase 作用方式 HO 5 3 3 5 DNA连接酶 ATP ADP 5 3 5 3 目录 DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用 在DNA修复 重组及剪接中也起缝合缺口作用 也是基因工程的重要工具酶之一 功能 DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication 第三节 一 复制的起始 需要解决两个问题 1
11、 DNA解开成单链 提供模板 2 合成引物 提供3 OH末端 一 原核生物的DNA生物合成 E coli复制起始点oriC 1 DNA解链 DnaA DnaB DnaC DNA拓扑异构酶 引物酶 SSB 3 5 3 5 2 引发体和引物 含有解螺旋酶 DnaC蛋白 引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体 3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子 引物 引物酶 二 复制的延长 复制的延长指在DNA pol催化下 dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上 其化学本质是磷酸二酯键的不断生成 OH3 3 目录 领头链的合成 目录 随从链的合成 目录 目录 阶段一 阶段
12、二 阶段三 阶段四 复制过程简图 目录 复制过程动画 原核生物基因是环状DNA 双向复制的复制片段在复制的终止点 ter 处汇合 三 复制的终止 随从链上不连续性片段的连接 目录 哺乳动物的细胞周期 DNA合成期 G1 G2 S M 二 真核生物的DNA生物合成 细胞能否分裂 决定于进入S期及M期这两个关键点 G1 S及G2 M的调节 与蛋白激酶活性有关 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用 真核生物每个染色体有多个起始点 是多复制子复制 复制有时序性 即复制子以分组方式激活而不是同步起动 复制的起始需要DNA pol 引物酶活性 和pol 解螺旋酶活性 参与 还需拓扑酶和复
13、制因子 replicationfactor RF 增殖细胞核抗原 proliferationcellnuclearantigen PCNA 在复制起始和延长中起关键作用 一 复制的起始 3 5 5 3 领头链 3 5 3 5 亲代DNA 随从链 引物 核小体 二 复制的延长 染色体DNA呈线状 复制在末端停止 复制中岡崎片段的连接 复制子之间的连接 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物 去除后留下空隙 三 复制的终止 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 3 3 5 5 目录 目录 切除引物的两种机制 目录 端粒酶 telomerase 端粒酶RNA humantelomerase
14、RNA hTR 端粒酶协同蛋白 humantelomeraseassociatedprotein1 hTP1 端粒酶逆转录酶 humantelomerasereversetranscriptase hTRT 组成 端粒酶的催化延长作用 爬行模型 目录 DNA聚合酶复制子链 进一步加工 目录 逆转录和其他复制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays 第四节 逆转录酶 reversetranscriptase 逆转录 reversetranscription 一 逆转录病毒和逆转录酶 逆转录病毒细胞内的逆转录现象 分子生物学研究可应用逆转录酶
15、 作为获取基因工程目的基因的重要方法之一 此法称为cDNA法 以mRNA为模板 经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链 试管内合成cDNA cDNA complementaryDNA 二 逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象 是分子生物学研究中的重大发现 逆转录现象说明 至少在某些生物 RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能 对逆转录病毒的研究 拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论 滚环复制 rollingcirclereplication 三 滚环复制和D环复制 是某些低等生物的复制形式 如 X174和M13噬菌体等 滚环复制 目录 D环复制 D loopreplication 是
16、线粒体DNA mitochondrialDNA mtDNA 的复制形式 DNA损伤 突变 与修复DNADamage Mutation andRepair 第五节 遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变 均可称为突变 在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤 DNAdamage 从分子水平来看 突变就是DNA分子上碱基的改变 一 突变的意义 一 突变是进化 分化的分子基础 二 突变导致基因型改变 三 突变导致死亡 四 突变是某些疾病的发病基础 二 引发突变的因素 物理因素紫外线 ultraviolet UV 各种辐射 化学因素 目录 三 突变的分子改变类型 错配 mismatch 缺失 deletion 插入 insertion 重排 rearrangement DNA分子上的碱基错配称点突变 pointmutation 一 错配 镰形红细胞贫血病人Hb HbS 亚基 正常成人Hb HbA 亚基 二 缺失 插入和框移 缺失 一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失 插入 原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间 框移突变是指三联体密码的阅读方式改变 造成蛋白质氨基酸排列
