《代谢组学开展实验方案》由会员分享，可在线阅读，更多相关《代谢组学开展实验方案（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、代谢组学实验方案 实验方案和实验细 节 终终止反应应 淬灭灭 培养基与菌体分离 胞内代谢谢物提取 胞内代谢谢物监测监测 数据分析 代谢组谢组 学解释释 代谢组学实验基本思 路 如何终终止 关键键因素 酶活 温度 溶剂剂 时间时间 方法 60 甲醇 50 甘油水溶液 5min 1h 如何分离 关键键 菌体形态态 发发酵液粘稠度 方法 离心 过滤过滤 如何提取 如何监测监测 如何分析 如何解释释 核心问题关键因素 关键键 细细胞壁 方法 超声破碎 研磨 反复冷冻冻 关键键 是否具有挥发挥发 性 论论文目的 方法 GC MS LC MS 或者两者联联用 关键键 数据是否具有同步性 系统误统误 差小
2、方法 Matlab NIST library Golm metabolome database AMDIS 关键键 解释释FK506高产产原因 方法 与FK506的合成相关联联 前体 分支代谢谢 能量 终终止反应应 淬灭灭 培养基与菌体分离 胞内代谢谢物提取 胞内代谢谢物监测监测 数据分析 代谢组谢组 学解释释 终终止反应应 淬灭灭 方案一 1 5mL 20mL 甘油 水 3 2 1 Villas B as S G and P Bruheim Cold glycerol saline The promising quenching solution for accurate intracell
3、ular metabolite analysis of microbial cells Analytical Biochemistry 2007 370 1 p 87 97 2 Smart K F et al Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography mass spectrometry Nat Protocols 2010 5 10 p 1709 1729 3 B l
4、ling C and O Fiehn Metabolite Profiling of Chlamydomonas reinhardtii under Nutrient Deprivation Plant Physiology 2005 139 4 p 1995 2005 方案二 2 5mL 20mL 甘油 生理盐水水 3 2 5min 5min 关键 终止酶活 方法 胞内温度 10 溶液温度 根据细胞壁的厚度而定 策略 用甲醇或者甘油降低水的凝固点 公式 Tf Tf Tf Kf m m为溶液的质量摩尔浓度 Kf 为凝固点下降常数 方案二 3 5mL 20mL 甲醇 水 3 2 可变动 5min
5、 培养基与菌体分离 终终止反应应 淬灭灭 培养基与菌体分离 胞内代谢谢物提取 胞内代谢谢物监测监测 数据分析 代谢组谢组 学解释释 关键 菌体的形态 发酵液的粘稠度 方法 离心 1 淬灭液 双蒸水 0 22 m 0 45 m 0 8 m 1 0 m 失败原因 丝状菌体 相互交联 堵塞孔 径 淀粉 葡萄糖 和糊精灭菌后 本身就是一 种 浆糊 严重堵塞孔径 废液缸 1 转速和时间 时间一般为4min 5min 转速的大小根据具体的菌体而定 离心结束后 菌体刚好贴在管壁 不结团 加入PBS或蒸 馏水后 轻微震荡即可重新悬浮 2 天然复合培养基面临的难题 天然复合培养基 主要为蛋白胨 酵母粉 成分复杂
6、 如果清洗不干净 会混入提取液中 严重影响实验结果 3 生理盐水中的NaCl和PBS中的钠盐 钾盐会干扰实验结 果 整个过程必须带手套 枪头不能接触其他物质 4 FK506发酵液的处理 转速为2700rpm 4min 采用去离子水洗涤菌体 将培养基中的酵母粉 不溶物 改为酵母提取物 可溶 过滤清洗 2 淬灭液 PBS或生理盐 水或蒸馏水 菌体沉淀 重复三次 1 Smart K F et al Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatizati
7、on followed by gas chromatography mass spectrometry Nat Protocols 2010 5 10 p 1709 1729 2 Ding M Z X Zhou and Y J Yuan Metabolome profiling reveals adaptive evolution of iSaccharomyces icerevisiae during repeated vacuum fermentations Metabolomics 2010 6 1 p 42 55 终终止反应应 淬灭灭 培养基与菌体分离 胞内代谢谢物提取 胞内代谢谢物监
8、测监测 数据分析 代谢组谢组 学解释释 胞内代谢谢物提取 关键因素 细胞壁 G 菌 单层 20 80nm 组 分简单 90 的肽聚糖 含量高 交联度大 10 的胞壁酸 G 菌 多层 10 15nm 组 分复杂 内壁层还有较 少的肽聚糖 含量低 交联度疏松 2 7nm 外膜层为脂多糖 磷脂 和脂蛋白 约8nm 真菌 厚25nm 占细胞干重的 25 分为三层 葡聚 糖 甘露聚糖和蛋白质 方法 三轮冷冻与解冻 液氮 196 中冷冻 5min 冰上0 解冻 15min 液氮 研磨 称量 反复冷冻超声破碎菌体研磨 终终止反应应 淬灭灭 培养基与菌体分离 胞内代谢谢物提取 胞内代谢谢物监测监测 数据分析
9、代谢组谢组 学解释释 气质联用 要求 沸点 350 分子量 1000 能完全气化 气化后对色谱柱和仪器无损伤 比如Ar 二氧化碳 水 甲醇 HCl和HNO3等 适用物质 主要是有机类小分子物质 包括烷 醇 胺 酯 醚 烯 酮 醛 羧酸 呋喃和吡啶衍生物 异氰酸酯 异硫氰酸酯 硫化物和一些脂类 特点 测定的物质少 相对于液质 灵敏度高 精度高 适合测定 nmol级的物质 关键因素 分子量 1000 沸点 350 或者通过衍生化 能够具有挥发 性 300 成气态 胞内代谢谢物监测监测 气质联质联用 终终止反应应 淬灭灭 培养基与菌体分离 胞内代谢谢物提取 胞内代谢谢物监测监测 数据分析 代谢组谢组
10、 学解释释 关键因素 分子量0 10 000 胞内代谢谢物监测监测 气质联质联用 已知化合物中约80 的化合物是 亲水性强 挥发性低的有机物 热不稳定化合物及生物大分子 这些化合物的分析不适宜用气相 色谱分析 只能依靠液相色谱 最终终的实验实验 方案 淬灭灭与提取 5mL 三轮冷冻与解冻 液氮中冷冻5min 冰中解冻15min 地点 东配 发酵液 地点 东配 地点 东配 地点 西配 震荡2s 25ml 40 的 60 甲醇 5min 40 乙醇浴 9 3500rpm 离心5min 5ml去离子水溶液 4 离心3次 9 5000g 离心5min 2ml 30 50 的甲醇溶液 9 5000g 离
11、心5min 2ml冷甲醇水溶液 50 vol vol 30 重新悬浮 9 5000g 离心5min 80 储藏 50 甲醇 4mL 60 甲醇 25mL 1个 2 63 NaCl 5mL 40 乙醇浴容器 1个 30 乙醇浴容器 1个 5mL移液枪 1mL移液枪 普通冰盒 1个 提前装好冰 离心机需提前30min调节温度至 9 80 冰箱需提前跟小闻老师协商 以上试剂必须提前一天在对应的温度保藏测定菌体干重 液氮 称取5mg 最终终的实验实验 方案 衍生化 80 储藏 0 5ml 1 5ml离心管 0 3mg ml 浓度231um l D4 succinic acid 50ul 1 5ml离心管震荡1min冷冻5min 1 5ml离心管 60ul 50ul 20mg ml甲氧胺盐酸 30 反应90min80ul MSTFA 37 反应90min 进样瓶 2h 冷冻干燥机 1 5ml离心管 材料 0 5mL离心管 1个 移液枪 1mL和100 L各一把 1 进样瓶 1个 水浴锅 提前1h调节温度 浮漂 个 实验过实验过 程与实验实验 数 据 单菌落斜面 28 13d 3层 纱布过滤 10 8个 mL 种子液 接种量 1mL 载液量 40mL 条件 28 46h 220rpm 500mL M1 M2 25 25 进风口 3 5d4 5d5 5d6 5d7 5d 取样检测
