MAEBT细胞培养技术

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1、细胞培养技术与应用细胞培养技术与应用 中山大学动物实验中心 细胞实验室 2014年09月10日 概述概述 随着现代医药生命科学的发展 细胞培养在其 领域和相关领域应用越来越广泛 目前 细胞可以用 来用来生产蛋白生物制品 临床上用于移植 用于检 测有毒物质 用于生理 病理 药理等方面的研究 为治疗和预防疾病提供理论依据 由于在培养中或机体内 细胞行为的基本规律是 一样的 因此许多研究可以在体外进行 更重要的是 在体外培养条件下 人们可以有目的 有选择的控 制细胞生长的因素环境 因此可以研究在某些特殊条 件下的细胞生物学行为 这里主要目的是介绍细胞培 养的基本概念和技术及其应用 体外培养中感兴趣的

2、研究领域体外培养中感兴趣的研究领域 l1 细胞内部的种种活动 如DNA的复制和转录 蛋白 质合成 能量代谢 l2 细胞内部的流动 如RNA从细胞核向细胞质方向运 转 激素受体复合物的易位等 l3 生态学 如营养 感染病毒或化学诱变 药物作用 l4 细胞与细胞之间的相互作用 如胚胎诱导 细胞群 体的动力学等 l5 组织工程 种子细胞 生物材料 l6 干细胞的研究与应用 内内 容容 一 细胞培养的基本理论 二 细胞培养的基本条件 三 基本的细胞培养技术 四 细胞培养技术的应用 一 细胞培养的基本理论一 细胞培养的基本理论 一 细胞培养技术的历史 二 基本概念 基本理论 一 细胞培养技术的历史 一

3、细胞培养技术的历史 1 1885年Roux最早尝试使组织离体培养 材料是鸡胚神经 板 采用生理盐水为培养液 并首次采用组织培养这个术语 2 1907年Harrison 和1912年Carrel开始把组织培养作为一种 方法 用于研究离体动物细胞的培养 3 1912年Carrel将无菌操作技术引入动物细胞培养 在动物 体液中发现促进细胞生长的因子 奠定了无血清培养研究基础 4 1962年Stile成功的大规模悬浮培养了小鼠肾细胞 BHK 从而为动物细胞大规模培养技术的发展奠定了基础 5 1967年Wezel和1972年Knazek先后创立了微载体和空纤维 细胞培养体系 使细胞培养技术提高到大规模培

4、养水平 体外培养技术的发展大致可分三个时期 50年代之前 细胞培养在多个领域发展时期 50年代是细胞培养迅猛发展时期 多种培养技 术相继建立 50年代后是体外培养技术与生命科学其他技术 结合发展的新时期 诞生了多种培养应用技术 我国体外培养技术的发展 20世纪50年代以后 如张钧 鲍鉴清分别在上 海 北京开展部分相关工作 1952 鲍鉴清 天津 第一实验室 1955 编写 第一本 组织培养技术 1995年 鄂征主编 组织培养和分子细胞学技术 一书 其他还有 郭辉玉 高尚荫 鄂征 陈瑞铭等 由于组织培养在医学研究中的应用 如抗病毒 疫苗的生产等 现已经逐渐发展成为一门精细技术 许多细胞株 细胞系

5、的培育成功 尤其是以人的 肿瘤组织为材料建立的各种细胞系 如Hela细胞系 Gey 1952 可用来进行一系列研究 更加促 进了组织培养技术的发展 在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有自发的两类不同 细胞间的融合细胞后 为细胞融合技术的发展和应用 及杂交瘤 技术奠定了基础 并推动了细胞生物学 细胞免疫学 细胞遗传学 病毒学等学科的交叉与发展 随着细胞生物学和分子生物学间 的相互渗透交叉 分子克隆技术与细胞培养技术相结合 在阐明 基因的结构和功能 基因在细胞生长和分化中的作用 以及细胞 癌变机制等方面起了重要作用 如基因的克隆及在细胞中的作用 克隆癌基因与细胞生长分化的关系 以及反义癌基因RN

6、A对细 胞转化的抑制作用的方面起了重要作用 二 基本概念 二 基本概念 1 体外培养分类 1 1 组织培养 Tissue Culture 指的是从体内取出组织摹拟体内生 理环境 在无菌 适当温度和一定营养条件下 使之生存和生长并 维持其结构和功能的方法 1 2 细胞培养 Cell Culture 是指从动物机体内取出相关的组织 将 它分散成单个细胞 然后放在适宜的培养基中 让这些细胞生长和 增殖 其原理是细胞分裂增殖 1 3 器官培养 Organ Culture 培养的是器官的原基 器官的一 部分或整个器官 使之在体外生存 生长和保持一定功能的方法 如下图 2 组织培养的细胞生物学特点 2 1

7、体内外细胞的差异 当人工条件和体内实际情况不完 全相同时 细胞在体外培养后 一旦失去神经体液调节和细 胞间相互影响 生活在缺乏动态平衡的环境中 发生变化则 是必然 细胞最多见的表现是 返祖 Atavism 现象 失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显 细胞趋单一化 不死性 恶性状 细胞增殖和分化是细胞生命进化中所获得的基本属性 增 殖使细胞数量增多 分化使机体结构和功能多样化 最后演 变成完整的有机体 2 2 培养细胞的分化 细胞分化机制是极其复杂的 是在细胞与细胞 细胞与体液和细 胞与细胞外基质相互作用下 众多基因参与 经过多阶段和多环节 完成的动态演变过程 不适应 Deadaption

8、 细胞在体内时所拥有的分化特性减弱 或不显 例如肝细胞在体外丧失了产生酪氨酸转移酶的特性 脱分化和去分化 Dedifferentiation 由于基因变异而使细胞 失去分化能力 如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特 性后 储存肝糖元的能力丧失 并很难再现 因此 不适应和脱分化是两个不同概念 不适应只是因为生存 条件改变而使分化发生抑制 从分子水平考虑 脱分化很可能是基因 变异所导致 3 培养细胞的形态 3 1 贴附型 1 成纤维细胞 心肌细胞 血管内皮细胞等 2 上皮型细胞 消化管外皮细胞 肝脏上皮细胞 等 3 游走型细胞 神经胶质细胞 4 多形型细胞 神经组织细胞 3 2 悬浮型 如癌

9、细胞和血液白细胞 4 4 体外培养细胞的生长增殖过程 体外培养细胞的生长增殖过程 原代培养期 从体内取出组织接种培养到第一次 传代培养这个阶段 一般持续1 4周 这个阶 段细胞比较活跃 有细胞分裂 但不旺盛 传代期 从原代培养的细胞的一经传代后便称细 胞系 细胞增殖旺盛 当传代10 50次后 细 胞增殖缓慢 以致完全停止 衰退期 细胞增殖缓慢或不增殖 细胞轮廓增强 最后衰退凋亡 4 1 原代培养 Primary Culture 期 即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段 一般持续1一4 周 此期细胞呈活跃的移动 可见细胞分裂 但不旺盛 初代培养 细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性较

10、大 细胞群是 异质的 Heterogeneous 也即各细胞的遗传性状互不相同 细胞 相互依存性强 如把这种细胞群稀释分散成单细胞 在软琼脂培养 基中进行培养时 细胞克隆形成率 Cloning Efficiency 很低 即 细胞独立生存性差 克隆形成率 即细胞群被稀释分散成单个细胞 进行培养时 形成细胞小群 克隆 的百分数 初代培养细胞多呈 二倍体核型 由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大 是检测 药物很好的实验对象 4 2 传代期 初代培养细胞一经传代后便称做细胞系 Cell Line 在全生 命期中此期的持续时间最长 在培养条件较好情况下 细胞增殖旺 盛 并能维持二倍体核型 呈二倍体核

11、型的细胞称二倍体细胞系 Diploid Cell Line 为保持二倍体细胞性质 细胞应在初代培养期 或传代后进行早期冻存 当前世界上常用的二倍体细胞一般不出十 代内冻存 如不冻存 则需反复传代以维持细胞的适宜密度 以利 于生存 但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化 一 般情况下当传代10 50次左右 细胞增殖逐渐缓慢 以至完全停止 细胞进入第三期 4 3 衰退期 此期细胞仍然生存 但增殖很慢或不增殖 细胞形态轮廓增强 最后衰退凋亡 在细胞生命期阶段 少数情况下 在以上三期任 何一点 多发生在传代末或衰退期 由于某种因素的影响 细胞 可能发生自发转化 Spontaneous Tran

12、sformation 转化的标志之 一是细胞可能获得永生性 Immortality 或恶性性 Malignancy 细胞永生性也称不死性 即细胞获持久性增殖能力 这样的细胞 群体称无限细胞系 Infinite Cell Line 也称连续细胞系 Continuous Cell Line 无限细胞系的形成主要发生在第二期末 或第三期初阶段 细胞获不死性后 核型大多变成异倍体 Heteroploid 细胞转化亦可用人工方法诱发 转化后的细胞也可 能具有恶性性质 细胞永生性和恶性性非同一性状 初代培养 细胞系 连续细胞系 老化传代期 0 2 4 6 8 10 12 14 周 16 14 12 10

13、8 6 5 组织培养细胞的传代培养 当细胞生长达到一定密度后 都需要做传代处理 传代的频率或间隔与培养液的性质 接种细胞的 数量和细胞增殖速度有关 所谓细胞 一代 即从细 胞接种到分离再培养的一段时间 如某一细胞系为 50代即该细胞已传代50次 Hayflick极限 体外培养的细胞增殖能力不是无限的 传代次 数有一定的界限 称为 Hayflick极限 传代次数与物种寿命有关 小鼠寿命3年 传 代12次 龟寿命200年 传代140次 传代次数与个体年龄成反比 人胚胎 40 60代 幼年 20 40代 成年 10 30代 早老病儿 童 2 10代 细胞传代的三个阶段 1 潜伏期 Latent ph

14、ase 细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间 2倍体细 胞该期时间长 24 96h 连续细胞系时间短 10 30min 2 指数生长期 Logarthmic growth phase 细胞增殖最旺盛时期 一般用细胞分裂指 数 Mitotic index MI 表示 即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数 体外培养细胞分裂指数 介于0 1 0 5 且受细胞种类培养液成分 pH 温度等影响 指数生长期是细胞活力最好的时期 在接种 细胞数量适宜情况下 指数生长期持续3 5d后 随 细胞数量不断增多 生长空间日趋减少 细胞相互 接触汇合成片 呈现接触抑制 Contact inhibition 而恶性细

15、胞则无接触抑制现象 因此接触抑制 可作为区分正常与癌细胞标志之一 但癌细胞则由 于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密 度抑制 Density inhibition 3 停滞期 Stagnate phase 即细胞数量达到饱和密度后 细胞与营 养液的交换面积减少 代谢产物积累 PH下降细 胞停止增殖 进入停滞期 在此时应及时进行 换液传代 否则因细胞中毒受损 大量细胞出 现死亡 至少再传1 2代后 细胞才能恢复 二 细胞培养的基本条件二 细胞培养的基本条件 一 仪器和设备 1 常规的细胞培养设备 超净台 CO2 孵箱 倒置显微镜 80 冰箱 液氮灌 2 培养器材 培养瓶 离心管 冻存管

16、纯水设备 干燥消毒除菌设备以及清 洗设备等 3 培养箱中控制条件 温度 36 5 0 5 湿度 100 CO2浓度 5 二 培养液 1 常用的培养基 目前常用的基础培养液均 有商品化 如RPMI1640 MEM DMEM F12 等 可根据培养需求合理选择 液体 粉末 hepes NaHCO3 2 配制低糖DMEM培养基 试剂名称 体积 质量 低糖DMEM培养基 干粉 10 0g HEPES 2 2g NaHCO3 2 0g 双抗 100 10ml 于超净台内操作 加入三蒸水 充分溶解后 三蒸水 定容到1000ml 0 22 m滤膜过滤 20 C保存备用 3 缓冲系统 常用为HEPES N 2 hydroxy ethylpiperazine N ethanesulfonic acid 缓冲效能 pKa 在20 时为7 55 37 为7 31 HEPES不是 起维持pH恒定的作用 而是起恒定和抵抗快速pH 变化的 所以调整pH常常用NaHCO3溶液 三 细胞培养添加剂 1 血清 一般最常用新生牛血清 胎牛血清 也用人血清和其它动物 血清 由于不同的研究目的 血清成分往往干扰研究实验 如进