动物细胞工程第二章动物细胞培养

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1、 成份和性状 本品系用狂犬病病毒固定毒株 CTN 1V株 接种Vero细胞株 培养后 收获病毒液 经 灭活病毒 浓缩 纯化 加入适量明胶 蔗糖保护剂 冻干制成 为白色疏松体 重溶后为澄明液体 无异 物 含硫柳汞防腐剂 第二章 动物细胞培养 内容提要 1 相关概念 2 体外培养细胞的生物学特性 3 影响细胞培养的理化因素 4 细胞培养的主要设备和仪器 5 细胞原代及传代培养方法 6 培养细胞的常规检测 7 无限细胞系的建立 8 动物细胞培养技术的应用 第一节 基本概念 1 动物细胞与组织培养是从动物体内取出 细胞或者组织 模拟体内的生理环境 在 无菌 适温和丰富的营养条件下 使离体 细胞或者组织

2、生存 生长并维持结构和功 能的一门技术 三个层次 细胞培养 组织培养 器官培养 应用极少 鸡胚胎成纤维细胞培养 10 40 人牙周膜组织培养至第6天细 胞自组织块边缘游出 10 10 小鼠肺组织块培养1w后游离 出的肺成纤维细胞 10 40 2 原代培养 primary culture 从体内 取出组织或细胞接种培养到第一次传代的 操作过程 3 传代或传代培养 passage culture 将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个 培养瓶的过程即称为传代或传代培养 胰酶消化法细 胞原代培养 传代培养 4 细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞 即称之为细胞系 如细胞系的生存期有限 则称之为

3、有限细胞系 已获无限繁殖能力 能持续生存的细胞系 称连续细胞系或无限细胞系 无限细胞系大多已发生异倍化 具异倍体核型 有的可能已成 为恶性细胞 因此本质上已是发生转化的细胞系 无限细胞系有的 只有永生性 或不死性 但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性 有的不仅有永生性 异体接种也有致瘤性 说明已恶性化 5 细胞株 通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特 殊性质或标志的培养细胞称为细胞株 从培养代数来讲 可培养到 40 50代以上 人正常胎肝细胞系 Hela 细胞株 p94 图4 31 6 细胞体外转化 in vitro transformation 细 胞在体外培养过程中发生与

4、原代细胞形态 抗 原 增殖或其他特性的可遗传的变化 P 96 98 转化的分子基础是DNA或基因的突变 一般可分 为自发转化和诱发转化 1 自发转化 发生 当对细胞进行冻存或者反复传代时 在 一些难以控制的因素影响下 即可发生自发转 化 如血清质量下降 病毒污染 温度和pH值 波动等 表现 核型异倍化 获得永生性 接触抑制消 失等 转化细胞形态上变得肥大 2 诱发转化 途径 化学诱变剂 MNNG MMS EUN等试 剂 物理射线处理 X射线 电离辐射 Co60 等 生物性因素 SV40 EBV等病毒处理 Ras myc等原癌基因转染 端粒酶基因转入等 3 细胞转化的检测 软琼脂培养法 浸润性检

5、测法 异种动物接种检测法 7 细胞一代时间 所谓细胞 一代 一词 指从细胞接种到分 离再培养时经历的一段时间 它与细胞倍 增一代非同一含义 如某一细胞系为第153代细胞 即指该细 胞系已传代153次 一般来讲 在细胞一代中 细胞能倍增3 6次 第二节 体外培养细胞的特征 一 体外培养细胞的类型 1 贴附型 这类细胞在培养时能贴附在支持物表面生长 大 多数培养细胞呈贴附型生长 特点 体内是立体贴附 细胞 组织 器官 体外为固相平面贴附 细胞形状与体内不 同 分类 判断细胞形态时不能按照体内组织学标 推 判定 仅大致分成以下四型 1 成纤维细胞型 名称 在培养中形态与成纤维细胞形态类似 来源 多由

6、中胚层间充质组织起源的组织如 真正的成 纤维细胞 心肌 平滑肌 成骨细胞 血管内皮 形态 似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则 三角形 胞质向外伸出2 3个长短不等的突起 中有卵圆形核 生长特点 排列成放射状 漩涡状 并不紧靠连成片 细胞与细胞接触易断开而单独行动 游离的单独 的成纤维样细胞 常有几个伸长的细胞突起 成纤维细胞 2 上皮型细胞 名称 仅形态上似体内 实际上不完全相同 来源 多来源于外胚层 内胚层细胞 如 皮肤及其 衍生物 消化道 乳腺 肺泡 上皮性肿瘤 形态 类似体内的上皮细胞扁平 不规则多角形 中 有圆形核 细胞彼此紧密相连成单层膜 生长特点 易相连成片 相靠 紧密相连

7、成薄层 铺石状生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而 单个活动 上皮型细胞 肿瘤性上皮细胞成串或小片状排列并有异型性 细胞丰满 呈圆形或多角 形 大而疏松的细胞核 核仁很明显 伴有较多的未成熟淋巴细胞 出现血 管周隙且肿瘤性上皮细胞围绕其成栅栏状排列HE 400 3 游走细胞型 本型细胞在支持物上散在生长 一般不连接成片 细 胞质经常伸出伪足或突起 呈活跃的游走或变形运动 速 度快而且不规则 此型细胞不很稳定 有时亦难和其它型 细胞相区别 在一定条件下 由于细胞密度增大联接成片 后 可呈类似多角形 或因培养基化学性质变动等 也 可能变成成纤维细胞形态 常见的有巨噬细胞 白细胞等 4 多形细胞型 有

8、一些细胞 如神经细胞难以确定其规律和稳定的形 态 可统归于此类 2 悬浮型 P65 图4 3 4 4 见于少数特殊的细胞 如某些类型的癌细胞及白血病细 胞 胞体圆形 不贴于支持物上 呈悬浮生长 这类细胞容 易大量繁殖 特点 在悬浮中生长良好细胞圆形 单个或小细胞团 优点 生存空间大 提供数量大 传代方便 不需消化 易于收获 可获得稳定状态 缺点 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长 二 体外培养细胞的超微结构 细胞外被 糖蛋白膜 利于细胞贴壁 细胞骨架 影响细胞的形态和运动 细胞器 线粒体 高尔基体 高尔基体等 细胞核 与体内正常细胞差不多 三 体外培养细胞的生长增殖特性 1 培养细胞的增殖态和功

9、能态 1 增殖态 指处于增殖状态的细胞 细 胞本身胞体不断长大 并持续分裂 2 功能态 分化态 指处于执行特定 功能活动 如分泌 传导 吞噬 收缩等 状态的细胞 3 二者的比较 增殖态 连续分裂细胞 功能态 G0细胞或终末细 胞 2 培养细胞的生命周期 1 原代培养 Primary Culture 期 也称初代培养期 即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶 段 一般持续1一4周 特点 细胞移动活跃 分裂相少 细胞群是异质的 细胞间相互依赖性强 独立生存性差 细胞 克隆形成率低 多呈二倍体核型 初代培养细胞与体内原组织在形态结构 和功能活动上相似性大 是检测药物很好的实验对象 2 传代期 初代培

10、养细胞一经传代后便改称做细胞系 Cell Line 特点 持续时间长 细胞增殖旺盛 细胞数量呈指数式增加 为维持二倍体核型 细胞应在传代后早期 十代 内冻存 反复传代可导致细胞失掉二倍体性质或发生转化 一般情况下当传代10 50次左右 细胞增殖逐渐缓慢 以至完全停止 细胞进入第三期 3 衰退期 此期细胞仍然生存 但增殖很慢或不增殖 细胞形态轮廓增强 最后衰退凋亡 细胞在此期也可能发生自发转化 转化的标志之一是细胞可能获得永 生性或恶性性 获持久性增殖能力 称无限细胞系 细胞获不死性后 核 型大多变成异倍体 3 每代贴附生长细胞的生长过程 1 潜伏期 Latent Phase 主要过程 游 离

11、吸 附 贴 壁 扩 展 细胞状态 可有运动活动 基本无增殖 少见分裂相 1 细胞密度 接种密度越大 数量越多 细胞群体越容易适应体外环境 潜伏期越短 2 细胞类型 传代细胞潜伏期比原代细胞短 单个细胞群快 细胞大团慢 组织块慢 连续细胞系与恶性转化的细胞比正常二倍体细胞的短 来源 胚胎组织细胞 成体组织 3 培养条件 培养液 pH 底物 污染 有毒 4 促帖附物质 潜伏期影响因素 2 指数增生期 Logarithmic growth Phase 特点 是细胞增殖最活跃 生长活力最旺盛的阶段 培养物中细胞数量呈指数增长 细胞群体均一 是理想 的实验用细胞 判断指标 1 有丝分裂指数 MI 2 细

12、胞群体倍增时间 3 MTT法 反映细胞内一种酶活性程度 细胞生长一定阶段 指数生长期一般持续3 5d 即可 长满培养器皿 相互汇合成片 铺满 当细胞相互接触连接成片 出现接触抑制 接触抑制以 后 虽然运动受抑制 但只要营养成分充足 仍可 短期的分裂增殖 如果细胞密度继续增大到一定程 度 细胞便不再分裂增殖 当细胞分裂停止后 细胞数量即不再增加进入平台期 3 停滞期 Stagnate Phase 细胞数量达饱和密度后 细胞遂停止增殖 进入停滞期 此时细胞数量不再增加 故也称平台期 Plateau 停滞 期细胞虽不增殖 但仍有代谢活动 继而培养液中营养渐趋 耗尽 代谢产物积累 pH降低 此时需做分

13、离培养即传代 否则细胞轻则中毒 发生形 态改变 重则从底物脱落死亡 故传代应越早越好 第三节 影响体外细胞培养的理化因素 动物细胞的体外培养 根本特点是模拟体 内的条件 因此 其重要的条件可以概括 为无菌 生长环境 PH值 温度等 和营养 三个方面 培养的动物细胞的存活 渗 透 压 水的质量 营养条件 气体条件 温度条件 条 件 PH 无菌条件 温度 37oC 0 5oC 一般来说 体外培养细胞对低温的忍耐力 比高温强 高温 蛋白质 酶等 45 1h死亡 41 42 10 24h后衰退 25 35 生长缓慢 4 以下几小时后复温至37 仍可生长 不同物种细胞对温度的要求稍有不同 哺乳类 37

14、鸡细胞 30 42 昆虫类 25 28 冷水鱼20 凉水鱼23 温水鱼26 渗透压 高渗或低渗溶液中 细胞会发生皱缩 或肿胀 破裂 哺乳动物和其他动物组织 细胞体外培养的渗透压的维持主要与NaCl 有关 但不能忽视其他电解质渗透压的关 系 哺乳类动物细胞的渗透压一般为290 300mmol L 人胚肺成纤维细胞为250 325mmol L 鼠则为310mmol L左右 在实际应用中 260 320mmol L的渗 透压可适于大多数细胞 气体环境和pH 气体环境 采用开放式培养时 一般要把细胞置于95 空气加5 二氧化碳的混合气体环境中 PH缓冲系统 一般7 2 7 4 NaHCO3 CO2 N

15、aHCO3易于分解 导致PH剧烈变动 对 细胞造成损伤 可采用开放培养 使细胞代谢产生的CO2及 时 溢出培养瓶 再通过稳定调节温箱中CO2浓度 5 与培 养 基中的NaHCO3处于平衡状态 Hepes 羟乙基哌嗪乙硫磺酸 它对细胞无毒性 性 质稳定 主要作用是防止pH迅速变动 在开瓶通气培养或活 细 胞观察时能维持较恒定的pH 无菌 无毒 无毒和无菌是体外培养细胞的首要环境条件 污染源主要是G G 真菌 支原体 预防措施 在培养基中加入相应抗生素 但 量不能太大 特别要注意防止支原体污染 无菌操作意识在动物细胞培养中非常重要 水 体外培养的细胞对水质特别敏感 对水的纯 度要求较高 培养用水中

16、如果含有一些杂质 即 使含量极微 有时也会影响细胞的存活和生长 甚至导致细胞死亡 用金属蒸馏器制备的蒸馏水 可能会含有某些金属离子 一般不作为培养用 水 配制培养用液应使用经石英玻璃蒸馏器三次 蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水 最好用龙头瓶贮存 存放时间一般不应超过2周 营养条件 维持细胞生长的基本营养条件至少应该 包括以下几个方面 1 氨基酸 是细胞合成蛋白质的原料 所 有细胞都需要12种必需氨基酸 缬氨酸 亮 异亮 苏 赖 色 苯丙 蛋 组 酪 精氨酸 胱氨酸 此外还需要谷氨酰胺 它 在细胞代谢过程中有重要作用 所含的氮是 核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源 同样也是合 成磷酸酰苷所需要的基本物质 体外培养的 各种培养基内都含有必需氨基酸 2 单糖 培养中的细胞可以进行有氧与 无氧酵解 产生能量 以供细胞生命活动 之需 体外培养动物细胞时 几乎所有的 培养基中都以葡萄糖作为必含的能源物质 不同细胞类型对G浓度的要求不一样 体细胞 癌细胞 干细胞 早期胚胎细 胞 丙酮酸钠也可以作为替代碳源 谷氨 酰胺与G可协同作用 3 维生素 主要扮演辅酶 辅基的角色 必不可少 生物素 叶酸 烟酰胺