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1、胃癌细胞表面,唾液酸糖链的表达与其与侵染、转移相关性的研究 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 摘 要本设计为了研究唾液酸在胃癌发病过程中的相关作用，探讨,唾液酸糖链结构在胃癌发生中所造成的影响。设计内容主要分为两部分：,唾液酸糖链结构在不同分化程度的胃癌细胞表面的表达对胃癌细胞侵染能力相关性的研究；,唾液酸糖链结构对胃癌细胞的转移能力相关性的研究；第一部分分为两个实验设计用MAL细胞化学染色法选出阳性细胞计算出MAL胃癌细胞的阳性率和体外细胞粘附试验测得吸光度测试唾液酸跟细胞粘度的关系；第二部分通过重组基底膜实验来计数胃癌细胞的穿膜细胞数，确定,唾液酸对胃癌细胞的侵染、转移的影响。为
2、胃癌疾病的研究和治疗提供一定的理论及实验基础。关键词：,唾液酸；表达；胃癌细胞；侵染；转移目 录第一部分： 文献综述1 唾液酸11.1简介11.2唾液酸的生物学功能12 胃癌22.1胃癌发生的过程22.2胃癌的侵染、转移23 唾液酸与肿瘤作用33.1唾液酸与恶性肿瘤33.2唾液酸与胃癌44凝集素54.1简介54.2 MAL简介54.3 MAL对胃癌细胞表面糖链的标记6第二部分 课程设计部分1材料71.1细胞株及细胞培养81.2试剂81.3试剂配制91.4仪器设备92方法102.1 MAL细胞化学染色102.2 体外细胞粘附试验112.3 重组基底膜侵袭实验113 设计123.1 胃癌细胞表面,
3、唾液酸糖链结构与其转移能力的相关性123.2 胃癌细胞表面,唾液酸糖链结构与其侵染能力的相关性124 总结125 设计体会13参考文献152第一部分 文献综述1 唾液酸1.1简介 唾液酸是一种神经氨酸乙酰衍生物，广泛分布于体内各组织中，被认为是重要的肿瘤标志物，并在检测疗效、复发和预后判断等方面都有一定的价值。唾液酸是一类含个碳原子的羧基化单糖酰化衍生物的总称，在人体的唾液酸主要为N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸两种，大多由葡萄糖代谢生成。唾液酸广泛分布于真核细胞表面糖蛋白或糖脂的寡糖链的最末端，是细胞膜上糖蛋白、糖脂的重要成分1。体内大多是葡萄糖代谢生成，在血清中以糖结合和脂结合两种形式
4、存在。根据唾液酸与糖残基的连接方式可将其分为, 2,3-、 2,6-或 2,8-三大类。1.2唾液酸的生物学功能唾液酸具有的末端定位性及带负电荷两大特性，使他们对调节细胞间、细胞与间质、细胞与分子的相互作用有特殊意义，在机体生理、病理过程中发挥重要的作用。唾液酸化修饰屏蔽了与之相连的糖蛋白及糖脂结构，稳定细胞膜结构，提高了热稳定性，并保护细胞和大分子不受酶及免疫系统的攻击，从而起保护细胞的作用。很多恶性肿瘤细胞和一些病原体则利用唾液酸修饰，逃避机体免疫监视和攻击。唾液酸作为识别为点，参与细胞识别及信息传递。唾液酸可被选凝素、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族等粘附分子识别。也是一些信号分子、病
5、原体如流感病毒的作用位点。表面唾液酸话使得细胞外表面带负电荷，有利于与带正电荷的物质结合，从而参与细胞水盐代谢、物质转运等生理过程。带负电荷的唾液酸具有亲水性，在周围形成很大的水合半径，造成细胞间距离的增加，并通过电荷排斥阻止分子间相互作用，所以说唾液酸对分子间甚至细胞间的相互作用都有潜在的抑制作用2 。这种特性可阻止血红细胞的凝聚、粘附，有利于细胞的迁移，对于人体的生理活动、生长发育有重要意义。唾液酸化修饰是生命活动所必需的，有实验证实抑制唾液酸的生物合成对幼鼠是致命的3。唾液酸在脑中的含量很高，它能够促进神经细胞的分化、发育和再生，参与突出的传递，参与记忆和学习功能，机体发育阶段各种组织唾
6、液酸表达水平较高。而在成年人的组织中则为低表达，如成年人组织中出现唾液酸化水平升高，则提示发生病变的可能。2 胃癌2.1胃癌发生的过程胃癌是最常见的恶性肿瘤，我国的病人主要以进展性胃癌为主，确诊时绝大多数已经发生转移，这是造成治疗失败的主要原因之一。因此，研究胃癌细胞的侵袭转移机制，早期发现和预测癌的转移、观察治疗效果和评价预后是胃癌研究的重要内容。与大多数肿瘤相类似的是，胃癌的侵袭与转移机制也极其复杂，参入的因素非常多，包括与细胞质/核有关的因素，细胞膜及表面结构的改变等，是一个多步级联过程。其中主要包括以下步骤：癌细胞从原发灶脱落；与细胞外基质(Extracellular matrix，E
7、CM)、基底膜(Basement membrance，BM)发生粘附并降解；穿越血管壁进入循环并到达远处部位；肿瘤血管形成；在继发部位不断增殖形成转移灶。在这些多步骤的动态、连续的侵袭转移过程中，癌细胞由原发灶脱落，是肿瘤发生侵袭转移的始动因素4。2.2胃癌的侵染、转移肿瘤细胞游走性增加，即肿瘤细胞之间及与周围组织粘附作用的减低是肿瘤细胞由原发灶脱落的主要原因。而粘附作用的减低又主要与肿瘤细胞表面糖蛋白糖链结构的改变有密切关系5。细胞膜糖蛋白是蛋白质和寡糖链(糖链)的共价复合物，其糖链在维持细胞分化、功能和形态方面起着非常重要的作用。一旦细胞膜表面糖链结构发生异常变化，就预示着其基本的生物学行
8、为发生了改变6-9，尤其在细胞的粘附、运动、分子识别及细胞识别等基本功能方面的改变，与肿瘤细胞的恶性增殖和转移有直接关系陋10。因此，研究细胞膜表面糖蛋白及糖链结构变化对于揭示肿瘤细胞的侵袭与转移是非常重要的。胃癌致死率高的两个重要因素是胃癌患者确诊时多数处于中晚期以及缺乏有效的治疗手段。胃癌患者治疗失败和致死的主要原因就是肿瘤的侵袭和转移。胃癌发生侵袭和转移是一个多基因、多阶段、连续复杂的过程，这一过程包括肿瘤细胞从原发灶脱离，穿越基膜及细胞外基质浸润迁移并进入血管，黏附于血管内皮，进入循环系统并随血流到达远处，穿出血管侵入细胞外基质并形成转移灶。癌细胞脱离原发灶后，穿越组织屏障是转移的关键
9、步骤。细胞外基质和基膜(BM)是肿瘤生长和扩散的自然屏障，细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)主要成份由胶原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基葡聚糖组成。ECM在上皮或内皮细胞的基底部，即以基底膜2usememmembranes，BM)的形式存在，在细胞间结构以间质结缔组织形式存在11。肿瘤细胞的侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动的相关基因及其表达调控模式的改变和促进细胞移动的外界因素两者的共同作用。虽然肿瘤细胞侵袭的分子机制还不是十分清楚，但已发现许多调控细胞侵袭转移的关键分子及其信号通路。肿瘤细胞通过其表面受体与ECM中的各种成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶类来降解基质，从而形成
10、局部溶解区，构成了肿瘤细胞转移运行通道。一般恶性程度高的肿瘤细胞具有较强的蛋白水解作用，可侵蚀破坏包膜，促进转移。目前研究认为，MMPs不但介导肿瘤细胞对宿主细胞外基质的降解，还控制肿瘤新生血管的生成，影响细胞黏附分子的功能及调控肿瘤细胞的生长等。而肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移所必须的，被认为是很重要的预后因素11。3 唾液酸与肿瘤作用3.1唾液酸与恶性肿瘤有关恶性肿瘤与唾液酸关系的研究是从发现恶性肿瘤血清唾液酸升高开始的。早在1955年，Winzle等首次报道，恶性肿瘤患者血清唾液酸升高。上世纪七十年代，国外学者们通过动物实验及人体肿瘤研究，证实一些恶性肿瘤个体血清唾液酸水平异常升高。到上世
11、纪九十年代，唾液酸开始作为血清肿瘤标志物用于临床。尽管血清唾液酸水平升高的机制尚未完全明确，但目前的研究普遍认为这是由癌变细胞过表达的唾液酸大量脱落入血所致。在一些非肿瘤性病变中，血清唾液酸也可能会升高，如：感染、炎症等，但一般而言，其升高幅度远较恶性肿瘤的为小，而且作有效抗感染治疗后可下降至正常。众多的研究提示恶性肿瘤患者血清唾液酸升高程度较非肿瘤性病变的大，所以尽管血清唾液酸对恶性肿瘤的诊断并非特异性，但具有较高的敏感性，联合检测血清唾液酸及其他肿瘤标记物对恶性肿瘤的筛查、早期诊断有很大的临床意义。有文献报道,血清唾液酸水平与肿瘤恶性程度、肿瘤临床分期相关,分化越低、分期越晚血清SA水平越
12、高;作有效治疗后血清唾液酸可下降，肿瘤复发、转移后又上升，提示血清唾液酸不但可作为恶性肿瘤辅助诊断的指标，还可作为病情发展、肿瘤消长的监测指标。然而，血清唾液酸检测并不是直接检测细胞表面的唾液酸表达情况，不能深入了解肿瘤细胞唾液酸表达的具体情况12。3.2唾液酸与胃癌细胞癌变过程中常伴有细胞膜表面糖蛋白N-糖链结构的异常改变，其中肿瘤细胞表面唾液酸化水平增加与肿瘤的恶性进展及早期转移有密切联系。有关唾液酸在人胃癌细胞表面表达的特异性及其临床意义的研究，国内外相关报道较少。唾液酸在胃癌细胞表面的表达与胃癌侵袭、转移潜能之间的相关性，尚有待进一步研究与探讨。利用能够特异性识别、结合NeuAc 2,
13、3Gal1,4GlcNAc/Glc唾液酸结构的朝鲜槐凝集素，检测2,3唾液酸在胃癌组织及其转移性淋巴结以及大肠癌组织中的表达。化学上，当糖链结构的末端连接上唾液酸便意味着糖链延伸的终止。因此，唾液酸一般是糖链末端结构。研究发现，SA是血清糖蛋白与糖脂生物效应的重要成分，在细胞的恶性转化中起特殊作用。而血清中存在一种新蛋白脂质，是含唾液酸的糖脂，是神经节甘脂的衍生物，而正常人缺少这种糖脂或含量甚微。这类糖脂结合唾液酸的异常升高与恶性肿瘤的发生密切相关。肿瘤细胞的转移和细胞表面糖复合物的异常表达特别是糖复合物末端的唾液酸化改变密切相关。由于它位于糖链末端并携带负电荷，唾液酸对分子之间甚至细胞间的相
14、互作用都有潜在作用。一方面唾液酸可通过增加肿瘤表面负电荷和掩盖其表面抗原，从而有利于肿瘤细胞在血液循环中逃避宿主免疫细胞的杀伤；此外，唾液酸的聚积，能够直接影响糖链分子的连接，增加细胞之间排斥性，可使得肿瘤细胞之间及与周围组织的粘附性降低，细胞容易由原发灶脱落而发生转移。胃癌细胞表面异常唾液酸化的发生可能是由于,唾液酸转移酶表达水平增加或活性增强，导致这种带负电荷的,唾液酸糖链结构在肿瘤表面增加，从而使得肿瘤细胞之间的粘附力减弱，转移能力增强。因此研究其细胞表面糖蛋白糖链结构特点，将有助于从新的角度探讨胃癌发病机制，为临床诊断及预测预后提供实验和理论依据。研究胃癌细胞表面MAL特异性识别、结合
15、的糖蛋白糖链结构特点，有可能利用这些特异性糖蛋白作为靶点或抗原，研制、开发其抑制剂或单抗，通过对末端糖链的修饰作用，消除或降低肿瘤细胞的恶性转移或侵袭性能，为临床提供新的治疗方法13。4凝集素4.1简介凝集素是一类糖结合蛋白，广泛分布于各种有机体中。凝集素的最大特点是能专一的识别糖蛋白或糖脂中某一特定的单糖或寡聚糖中特定的糖基序列而与之结合14。细胞膜及细胞浆内存在凝集素受体，正常情况下这种凝集素受体相对稳定，当细胞恶变时，受体的数量和性质随机改变。利用凝集素具有与特定糖基转移性结合的特性，将其作为分子探针检测肿瘤细胞表面及细胞内糖基受体的分布，研究肿瘤细胞的恶性进展和侵袭、转移情况，对于肿瘤的早期诊断、监控肿瘤进展及评价预后具有重要的临床价值13。4.2 MAL简介植物凝集素MAL是从植物朝鲜槐的种子中提取的一种糖结合蛋白，是一种有效的淋巴细胞有丝分裂促进剂。研究发现MAL对NeuAc 2,3Gal1,4GlcNAc/Glc这一完整的三糖结构具有特异性识别与结合作用，且MAL仅能够识别N-型糖链的末端唾液酸，
