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1、流式细胞术在白血病 MICM分型诊断中的作用 肿瘤学实验室 林丁 重庆市肿瘤医院 肿瘤研究所 M morphology 形态学 I immunology 免疫学 C cytogenetics 细胞遗传学 M molecular biology 分子生物学 molecular genetics 分子遗传学 M morphology 形态学 FAB分型 髓系 acute nonlymphocytic leukemia ANLL acute myeloid leukemia AML M0 急性髓细胞白血病微分化型 M1 急性原粒细胞白血病未分化型 M2 急性原粒细胞白血病部分分化型 M3 急性早幼粒
2、细胞白血病 M4 急性粒 单核细胞白血病 M5 急性单核细胞白血病 M6 急性红白血病 M7 急性巨核细胞白血病 淋系 acute lymphocytic leukemia ALL L1 原幼淋巴细胞以小细胞为主 L2 原幼淋巴细胞以大细胞为主 L3 大细胞为主 细胞质多 深蓝 蜂窝状 I immunology 免疫学 分化簇 cluster of differentiation CD CD1 CD350 I immunology 免疫学 Type of cellCD markers stem cellsCD34 CD31 all leukocyte groupsCD45 Granulocyt
3、eCD45 CD15 CD24 CD114 CD182 MonocyteCD45 CD14 CD114 CD11a CD91 T lymphocyteCD45 CD3 T helper cellCD45 CD3 CD4 T regulatory cellCD4 CD25 and Foxp3 Cytotoxic T cellCD45 CD3 CD8 B lymphocyteCD45 CD19 or CD45 CD20 CD24 ThrombocyteCD45 CD61 Natural killer cellCD16 CD56 CD3 CD31 CD30 C cytogenetics 细胞遗传学
4、染色体核型分析 chromosome karyotyping C cytogenetics continued 荧光原位杂交 fluorescence in situ hybridization FISH 介于分子生物学与细胞遗传学之间的分子细胞遗传学 M molecular biology 分子生物学 molecular genetics 分子遗传学 基因突变 gene mutations 融合基因 fusion genes BCR ABL TEL AML1 流式细胞术 Flow Cytometry FCM 国内临床常用3种流式分析仪 BC Cytomics FC500 BC Epics X
5、L BD FACS Calibur Skip others 高端流式细胞仪 FACSCanto II 1 全数字化 2 临床型 3 3个激光 4 8色荧光 5 全自动开关机 LSR II 1 科学研究型 2 262144通道数 3 4个激光 4 10色荧光 5 UV激光 高端流式细胞仪 续 FACSAria II 1 高速分选 2 分选精度1 32滴 3 3个激光 4 13色荧光 5 仪器随开随用 Influx 分选仪 1 模块化设计 2 200 000 秒 分析 50 000 秒 分选 3 5个激光 4 24色荧光 5 无菌环境 back FCM原理 动画 FACSCalibur光路图 流式
6、细胞术的简单步骤 标本 外周血 骨髓 体液 脑脊液 胸水 腹水 组织 淋巴结 肝 脾 标本保存 抗凝血 室温 15 25 放置时间超过24小时 最好使用肝素抗凝 4 标记染色前半小时复温至室温 标本处理 无需特殊处理 全血标记不推荐使用淋巴细胞分离液 抗凝剂选择 血液 EDTA 超过24小时不稳定 ACD 细胞72小时内稳定 肝素 72小时内稳定 骨髓 肝素 一 标本准备 流式细胞术的简单步骤 续 全血标本 血细胞计数仪计数 绝对计数管 昂贵 细胞浓度 按说明书比例操作 残存白血病检测需要加大样本比例 二 细胞计数 流式细胞术的简单步骤 续 表面抗原 1 荧光素 FITC PE PerCP A
7、PC等 标记的单克隆抗体试剂中 加 入 适量标本混匀 室温避光孵育15分钟 2 加入溶血素 混匀 室温避光10分钟 3 用PBS洗涤 300g 离心5分钟 4 不能及时检测时 加多聚甲醛 4 保存 三 免疫荧光染色 细胞内抗原 1 膜表面抗原染色 同前 2 透膜 使用透膜剂 室温15分钟 300g 离心5分钟 3 用相应荧光标记的单克隆抗体标记胞 核 内抗原 室温避光孵育30 分钟 4 洗涤 5 不能及时检测时 加多聚甲醛 4 保存 流式细胞术的简单步骤 续 四 上机检测 五 质量控制 单细胞悬液制备质量控制 适当的制备方式 溶血处理 组织标本处理 温度与pH 免疫荧光染色的质量控制 温度 p
8、H 荧光染料的浓度 固定剂 设置对照 阳性对照 阴性对照 正常对照 荧光素的特性及应用 数据分析和报告 一 数据分析 常用数据显示方式 检测信号及意义 散射光信号 前向散射光 forward scatter FSC 细胞大小 检测信号及意义 散射光信号 侧向散射光 side scatter SSC 胞内颗粒多少 检测信号及意义 FSC SSC 二维点图 dot plot 中性粒细胞 单核细胞 淋巴细胞 阈值 细胞碎片 检测信号及意义 荧光信号 根据荧光素交联的单克隆抗体不同而表达不同的意义 一 设门 gating 二 荧光强度 三 单参数分析 四 多参数分析 二 数据解释及报告 1 定性的描述
9、 阳性或阴性 2 评估抗原表达强度 3 区分弱阳性和阴性群体 运用流式分析造血细胞的抗原表达情况 远远多于对形态学结果的简单证 实 能够提供大量的信息 可能帮助形态学确认某些诊断 也可能提出之前 没有考虑的诊断 在一些典型表现下 流式免疫分型可以在其他方法的辅助 之下诊断疾病 但是 流式免疫分型结果的解释应与临床 形态学 细胞遗传学等其他方 法结合使用 综合考虑 做出疾病的诊断与分类 正常血细胞发育过程的抗原表达规律 按 WHO造血和淋巴组织肿瘤分类 2008年版 Wood B etc 2007 急性白血病的免疫表型 急性髓细胞白血病的免疫表型 刘艳荣 等 2010 急性淋巴细胞白血病的免疫表
10、型 急性系列不明型白血病的免疫表型 慢性淋巴细胞白血病的免疫表型 一 CLL的免疫表型特点 二 FCM检测CLL的预后指标 1 ZAP 70 ZAP 70 CLL预后不好 2 CD38 是CLL疾病侵袭的重要标志 CD38 B CLL患者预后不好 三 鉴别单克隆B淋巴细胞增多症 单克隆B淋巴细胞增多症 MBL 指健康个体外周血中存在低水平的单克隆性B 淋巴细胞增多 四 鉴别诊断 CLL是以外周血及骨髓中成熟的淋巴细胞增多为主要临床特点的恶性疾病 除 了CLL 还包括其他多种生物学上完全不同的成熟B淋巴细胞肿瘤 正确鉴别将有 助于预后评估和治疗方案的选择 免疫分型的抗体组合原则 一 常用抗体 白
11、细胞分化抗原 leukocyte differentiation antigen 是指血细胞在分化成熟 为不同谱系 不同阶段及细胞活化过程中 出现或消失的细胞表面标记分子 1982年 国际统一使用分化群 cluster of differentiation CD 作为白细胞 分化抗原和相应单克隆抗体的命名 CD分子在流式细胞术的血液学应用中发挥着 重要作用 CD1a 表达于皮质胸腺细胞 树突状细胞和Langerhans细胞 主要用于T淋巴细 胞白血病及淋巴瘤的免疫分型 表达CD1a的T ALL为皮质型 CD2 泛T细胞标志 表达于T淋巴细胞 胸腺细胞和大多数NK细胞上 急性T淋 巴细胞白血病
12、acute T lymphoblastic leukemia T ALL 成熟T细胞增生异常 性疾病 急性双表型白血病 原始NK细胞淋巴瘤 白血病 肥大细胞白血病及少部 分急性髓细胞白血病 acute myeloid leukemia AML 尤其是变异性急性早幼 粒细胞白血病 acute promyelocytic leukemia APL 中有CD2表达 CD3 表达于T淋巴细胞 胸腺细胞和NK细胞 是T细胞增值性疾病中最特异的 标志 在成熟和部分初始T细胞中均有表达 胞浆CD3 cCD3 在初始T细胞 前 胸腺细胞 上表达 胸腺细胞表达胞浆和 或 膜表面CD3 mCD3 前体T细 胞肿瘤
13、通常不表达mCD3 但cCD3为阳性 免疫分型的抗体组合原则 CD4 表达于辅助性T淋巴细胞 外周血单核细胞 巨噬细胞和树突状细胞 大多 数外周血T细胞淋巴瘤 部分AML 慢性粒单核细胞白血病 acute myelomonocytic leukemia CMML 急性单核细胞白血病 AML M4 M5 APL和组织细胞肿瘤中伴有CD4表达 少部分T ALL中有CD4限制性表达 大多数 T ALL同时表达CD4 CD8或者两者同时为阴性 CD5 主要表达于胸腺细胞 成熟T淋巴细胞和B淋巴细胞亚型 作为一个泛T细 胞抗原 CD5可表达于成熟或不成熟T细胞增值性疾病中 包括T ALL 在肿瘤性 T细
14、胞发育过程中 CD5容易丢失 正常人外周血和淋巴组织中存在CD5 B细胞 儿童及年轻患者更多见 CD5主要表达于慢性淋巴细胞白血病 B cell chronic lymphocytic leukemia B CLL 小淋巴细胞淋巴瘤 small cell lymphocyte lymphoma SLL 和套细胞淋巴瘤 mantle cell lymphoma MCL 少部分弥 漫大B细胞淋巴瘤 diffuse large B cell lymphoma DLBCL 表达CD5 而且原 发性CD5 DLBCL预后较CD5 DLBCL更差 CD7 主要表达于T淋巴细胞 NK细胞和多能干细胞 在T细
15、胞发育过程中 CD7是最早出现的T细胞标志 且贯穿表达于整个T细胞分化发育过程中 在外周T 细胞异常性疾病中 CD7通常表达异常 减弱或消失 T ALL中CD7阴性表达者仅 占2 此外 CD7还可表达于原始NK细胞淋巴瘤 白血病和AML 而APL和B系淋 巴增值性疾病中 CD7表达多为阴性 免疫分型的抗体组合原则 CD8 表达于杀伤性或抑制性T淋巴细胞 胸腺细胞和某些NK细胞上 大部分大颗 粒T淋巴细胞白血病 T large granular lymphocyte leukemia T LGL 和肠型淋巴 瘤 少部分外周T细胞增值性疾病表达CD8 极少T ALL表达CD8 而CD4阴性 CD9
16、 表达于单核细胞 前B细胞亚群 激活的T细胞 嗜酸与嗜碱性粒细胞 血 小板 主要用于急性白血病免疫分型及微量残留病的检测 CD10 又名急性淋巴细胞白血病共同抗原 common acute lymphoblastic leukemia antigen CALLA 表达于前B 前T淋巴细胞 生发中心B细胞和成熟 粒细胞绝大多数急性B淋巴细胞白血病 B ALL 少数T ALL 多数滤泡性淋巴瘤 follicular lymphoma FL 部分DLBCL和Burkitt淋巴瘤 少数AML M5中有 CD10表达 成熟粒细胞缺乏CD10的表达常常与骨髓增生异常综合征 myelodysplasia MDS 相关 在FL和DLBCL中 CD10 者预后更好 CD11b 表达在单核细胞 粒细胞和部分NK细胞上 成熟B和T细胞不表达 部分 急性髓细胞白血病表达CD11b 常代表单核细胞的分化 AML M0 M1和M2很少表 达 APL通常也是CD11b阴性 常用CD11b观察MDS中单核和粒细胞的发育分化 CD11c 单核细胞和组织巨噬细胞中强表达 粒细胞中表达强度较低 正常激活 的CD8 细胞也可
