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1、Westernblot实验技术 Westernblot原理 WesternBlot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶 SDS PAGE 电泳分离蛋白质混合物 经过SDS PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物 NC膜 PVDF膜等 上后 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质 且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原 与其对应的抗体起免疫反应 再与酶标记的二抗体起反应 经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理 SDS是一种离子性的界面活性剂 它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链 当SDS与蛋白质混合时 它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸
2、结合将蛋白质包起来 而以硫酸根离子外露与水分子作用 大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1 1 4 以重量为单位 而蛋白质结合固定比例之SDS後 由於SDS带强负价 使蛋白质原先的带电价微不足道 且每单位重量之蛋白质带电价一致 chargedensity 所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素 丙烯酰胺和N N 亚甲双丙烯酰胺 SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵 时间 Tris 甘氨酸电泳缓冲液 凝胶成份 分子筛效应 凝胶浓度 凝胶孔径 机械强度 TEMED促使AP形成氧自由基 进而催化Acr单体为长链 Bis再使长链彼此联成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶 PAG AP TE
3、MED系统 单体 丙烯酰胺 Acr 交联剂 甲叉双丙烯酰胺 Bis 催化剂 过硫酸铵 AP 诱发剂 四甲基乙二胺 TEMED 氧自由基 聚丙烯酰胺凝胶 注 O2为终止剂 上样缓冲液 Loadingbuffer 浓缩胶 分离胶 Tris HClpH6 8 Tris HClpH8 8 Tris HClpH6 8 甘油 SDS 巯基乙醇 溴酚蓝 转膜缓冲液 transferbuffer tris HCl glycine 电泳缓冲液 runningbuffer tris HCl glycine SDS Acrylamide bis SDS AP TEMED SDS PAGE 两胶三缓冲 sample
4、电泳三离子 glycine Cl Protien SDS 带负电的蛋白胶束 消除电荷差 构像差 浓缩胶 分离胶 pH6 8 pH8 8 SDS PAGE Cl glycine protein HCl全部解离成Cl 迁移最快 走在最前 先导离子 甘氨酸仅有0 1 1 解离成Gly 迁移最慢 走在最后 尾随离子 重点理解 先导快离子后方 离子强度 低电导区 电场强度 使glycine和protein加速移动 蛋白样品受 夹板气 被 压缩 达 稳态 浓缩胶 分离胶 甘氨酸大量解离 迁移加快 走在蛋白前 跟着Cl 跑了 样品蛋白在均一的电场强度和PH中 尽情 泳动 根据样品成员的分子大小 不同的迁移率
5、 实现分离 分子越小 跑得越快 Cl glycine protein 小分子 大分子 中分子 高E 低E 压缩 分离效应 大致流程 提取与处理样品蛋白电泳分离样品蛋白转移蛋白至杂交膜封闭非特异性位点一抗孵育洗涤二抗孵育洗涤底物显色或曝光检测 明确蛋白样品的来源 组织 细胞 体液 选择适当的裂解方式 研磨 超声 剪切 冻融等 选择适当的裂解buffer SDS RIPA NP 40 商品化试剂盒 加入合适的蛋白酶抑制剂 Aprotinin PMSF leupeptin pepstantinA PIC EDTA EGTA 蛋白样品提取问题 浓缩 纯化 脱盐 离心 超滤 透析 冻干 变性样品 SDS
6、 阴离子表面活性剂 断开氢键 取消疏水作用 去除多肽折叠 屏蔽蛋白电荷量 高温 95 100 5 15min 大多数蛋白 70 5 10min 多次跨膜蛋白 还原样品 巯基乙醇 强还原剂 断开二硫键 破坏二三级结构二硫苏糖醇 DTT 还原剂 断开二硫键 破坏二三级结构 蛋白样品处理问题 蛋白样品处理问题 根据目的蛋白的状态确定电泳条件 抗体识别蛋白的空间型抗原表位时 不可加热及SDS变性抗体识别蛋白的氧化状态时 就不可加还原剂 巯基乙醇或DTT 胶类型的选择 PAGE SDS PAGE tricine SDS PAGE IEF 2D胶的浓度选择 蛋白大小 数目 个人经验配胶时间 忌即配即用 防
7、凝固不均 忌长期冰箱放置 防SDS结晶 保存 4天 防SDS水解聚丙烯酰胺 配胶温度 室温或37 配胶试剂 AP 现用现配或分装冻存TEMED 最后加 边加边晃Tris HCl 上下胶pH勿混 上6 8 下8 8 丙烯酰胺 神经毒性 配胶问题 蛋白上样问题 上样的总蛋白量根据蛋白表达丰度及研究目的调整适当的蛋白上样量 20 70ug细胞 组织裂解液 100ng纯化蛋白 上样的总体积1 30ul 小板 1 0ul 大板 各孔上样量一致每孔上样量尽量保持一致 以防条带倾斜 上样孔的选择忌烂孔 因氧气进入 忌不洁孔 多因上胶位置玻璃未洗净 忌不齐孔 因上样孔底部有气泡 碎胶 未冲孔 不均匀缩胶 不正
8、确拔梳 等 膜的选择问题 PVDF膜的选择问题 转膜缓冲液问题 最好现用现配 夹心结构问题 夹心结构 正 滤 膜 胶 滤 负大小 滤纸 膜 胶注意事项 膜用甲醇预处理 膜随时保持湿润 传统 尽量使用新滤纸 各层叠放次序正确 不能有气泡平衡问题 膜与胶泡于转膜缓冲液中 5 120min 蛋白分子愈小 时间愈短 纤维垫 转膜效果问题 透视法 考马斯亮蓝染色丽春红 可逆 酰胺黑CPTS总蛋白染色 丽春红S染色法 带负电丽春红S与带正电的氨基酸残基及蛋白的非极性区结合 从而形成红色条带 透视法 干燥PVDF膜后 20 甲醇浸湿 蛋白区透明 方便 可逆 蛋白不损 无需染料 转膜方式 电泳转移 半干转 湿
9、转 虹吸转移转膜电压 10 25V 半干转 转膜电流 1 2mA cm2 10 gel 转膜问题 虹吸转移 膜 滤纸 胶 膜 滤纸 胶 滤纸 转膜问题 转膜时间根据蛋白分子量 胶浓度 具体情况决定 检测多个蛋白时 需进行切胶 分别转膜 使用0 2 m的PVDF转印膜 PSQ 呈淡蓝色 转移缓冲液中适当增加甲醇 防止平衡时小分子流失 转移缓冲液中适当减少SDS 防止SDS抑制膜与蛋白的结合 降低凝胶的平衡时间 10min 降低电泳转膜时间 25min tricine SDS PAGE 小分子蛋白的 流穿 问题 封闭问题 定义 使用含有惰性蛋白质或非离子去污剂的缓冲液 PBST TBST 封闭杂交
10、膜上的非特异性位点举例 non fatmilk 脱脂奶粉BSA 胎牛血清 casein 酪蛋白 Tween 20 吐温 20 gelatin 明胶 商业化的封闭试剂 封闭问题 注意事项 抗磷酸化抗体不能用酪蛋白或含磷酸酶的封闭液 生物素 刀豆蛋白交联二抗不用脱脂牛奶同种封闭液的批间差异完全溶解 过滤去除难溶颗粒牛 羊 马源的一抗尽量不用BSA或脱脂奶粉 一抗 根据目的蛋白的性质 种属选择合适一抗 注意一抗的种属 单 多克隆及适用方法等 根据说明书推荐或预实验优化最佳稀释比例 加叠氮钠 分装保存 忌反复冻融 二抗 根据一抗的来源种属以及Ig亚型 G A M等 选择合适二抗 选择合适的标记物 HR
11、P AP GOD 生物素 荧光素 胶体金 加或不加硫柳汞 分装保存 忌反复冻融 根据说明书推荐或预实验 Dotblotting 优化最佳稀释比例 抗体问题 Dotblot 设置合适的对照组阳性对照 明确表达目的蛋白 用于检测抗体的工作效率阴性对照 明确不表达目的蛋白 用于检测抗体的特异性二抗对照 不加一抗 用于检测二抗的特异性及stripping效果内参对照 检测实验体系是否正常工作 进行半定量分析空白对照 不加一抗和二抗 用于检测膜的封闭及stripping效果 对照问题 内参问题 根据内参蛋白与目的蛋白的分子大小选择根据内参蛋白的存在部位确定内参不受实验处理因素影响 适用于检测两种分子量接
12、近的蛋白适用于检测目的蛋白的特定修饰状态50 150 200rpm 30min 需加 巯基乙醇 商品化温和的洗脱液 37 60rpm 10 30min 若不换抗体 可不Stripping而直接封闭加抗体检测 通过二抗对照及空白对照检测Stripping效果 Stripping问题 无信号 白板 或弱信号 不是白板胜似白板 高背景 黑板 几尽黑板 非特异性条带 杂带 脏带 操作 补丁染色表情条带 微笑 皱眉 闹鬼 鬼带 鬼影 拖尾 纹理 偏斜 过长 过粗条带其它 WB常见问题 样品样品中无目的蛋白或目的蛋白降解 设立阳性对照 检查封闭液是否有蛋白酶 使用蛋白酶抑制剂上样量不够或蛋白表达丰度较低
13、增加上样量 浓缩纯化样品2 转膜转膜不完全 转膜后使用丽春红染色 使用蛋白质Marker 洗涤过度 减少洗涤时间和次数 3 封闭封闭过度 减少封闭液浓度及封闭时间 更换封闭试剂4 抗体孵育和检测头抗体浓度和孵育时间不够 增加抗体浓度 延长孵育时间一抗不工作 设置阳性对照二抗不工作 和其他一抗配合检测二抗是否工作一抗 二抗不匹配 检查抗体的来源和亚型 正确选择二抗底物失活或灵敏度低 重新配制有效的底物 更换高灵敏度底物 无信号 弱信号问题 白板 1 封闭封闭时间不够 延长封闭时间优化封闭试剂的类型和浓度封闭液和抗体有交叉反应 更换封闭液 加Tween 20减少交叉反应磷酸化抗体不能使用含有酪蛋白
14、的封闭液 推荐BSA封闭2 抗体孵育和检测一抗 二抗浓度太高 降低抗体浓度 主要是二抗 孵育温度太高 建议4度孵育过夜3 其他洗膜不充分 5 3mins 多次短时间的洗膜曝光时间过长 缩短曝光时间出现干膜现象 保证膜充分浸透 避免出现干膜二抗非特异性 设置只加二抗对照 背景高问题 黑板 底片曝光 1 样品制备二聚体或多聚体 还原变性电泳蛋白不同剪切体或isoforms 实验论证蛋白降解 使用新鲜样品 加蛋白酶抑制剂上样量过大 减少上样量2 封闭封闭不充分 优化封闭时间和浓度3 抗体孵育和检测一抗 二抗浓度过高 降低抗体浓度 主要是一抗 抗体没有经过纯化 纯化或更换抗体二抗非特异性结合 使用二抗
15、对照4 其他洗膜保证充分 杂带问题 适当稀释一抗 提高特异性适当稀释二抗 降低背景 杂带 目的条带 操作问题 一抗浓度不够 增加一抗浓度抗体孵育不均匀 摇床干膜 保持湿润细菌污染 加防腐剂或更换抗体 配制新鲜缓冲液 补丁染色问题 微笑条带 主要由于凝胶中部聚合不完全 多见于较厚凝胶 也可由于上样量过大 室温静置充分凝固 调节上样量皱眉条带 凝胶和玻璃挡板底部有气泡或凝胶两边聚合不完全或上样量过大 在两板间加入适量缓冲液 完全凝胶 重新配胶 调整上样量 表情条带 鬼带 A大分子构象复杂蛋白质分子未完全变性或轻微复性 B高含量高纯度蛋白存在 充分变性还原 C抗体的重轻链 加热煮沸后 再添加适量的D
16、TT或Beta巯基乙醇 以补充不足的还原剂 或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化 分离或过滤样品 抗体来源 鬼影 条带的中心透亮 上样量过大 目的蛋白过多 适当减少上样量 鬼问题 目的条带 鬼带 条带偏斜 电极不平衡或者加样位置偏斜或蛋白上样不均 正确安装 加样 上样均匀条带两边扩散 加样量过多 减少上样量 偏斜与扩散 溴酚蓝不能起到指示作用 溴酚蓝已跑出板底 但蛋白质却还未跑下来的现象 主要与缓冲液和分离胶的浓度有关 更换正确pH值的Buffer 降低分离胶的浓度 较粗条带 样品浓缩不佳或上样量过大 适当增加浓缩胶长度 保证浓缩胶的pH6 7 适当降低电压 减少上样量 电泳电压很高而电流却很低 电泳槽没有正确装配 电流未形成通路 包括 a 内外槽装反 b 外槽液过少 c 电泳槽底部的绝缘体未去掉 比如倒胶用的橡胶皮 d 上样孔中过多气泡 正确装配电泳槽 增加电泳液 以电泳缓冲液赶走气泡 浓缩胶与分离胶断裂 拔梳子用力不均匀或过猛 封闭下胶的水或正丁醇未弃净 温柔拔梳 弃净上胶部液体 重新配胶板间气泡 a 解除制胶夹后 板未压紧而致空气进入 b 解除制胶夹 用力过大 温柔并正确操作 气
