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1、第九章 DNA的重组与转座 n重组的定义 n遗传重组的类型 n同源重组的分子机制 n重组和酶 n位点特异性重组 n转座 n转座的机制 n遗传重组的应用 6 0 重组 nDNA分子的断裂和重新连接导致遗传信息的重新 组合 称为重组 recombination 重组的产物 称为重组DNA recombinant DNA 所有的 DNA都是重组DNA 由于重组 一个DNA分子的 遗传信息可以和另一个DNA分子的遗传信息结合 在一起 也可以改变一条DNA分子上遗传信息的 排列方式 DNA重组广泛存在于各类生物中 说 明重组对物种生存具有重要意义 通过重组实现 基因的重新组合使物种能够更快地适应环境 加
2、 快进化的过程 此外 DNA重组还参与许多重要 的生物学过程 比如重组在DNA损伤修复和突变 中发挥重要作用 6 1 遗传重组的类型 根据对DNA序列和所需蛋白因子的要求 可有三 种类型的重组 其共同点是这些过程都涉及双链DNA 之间的物质交换 但其发生的情况有所不同 遗传重组的三种类型 1 同源重组 它的发生是依赖大范围的DNA同源序列的联会 在重组过 程中 两个染色体或DNA分子交换对等的部分 需要重组的蛋白质参与 eg 大肠杆菌中的RecA蛋白 RecBCD 蛋白 蛋白质因子对DNA碱基序列的特异性要求不高 存在重组热 点和序列长度的影响 真核生物染色质的状态影响重组的频率 特点 同源重
3、组可能发 生在两条同源的 DNA的任意位点 3 异常重组 完全不依赖于序列间的同源性而使一段DNA序列插入 另一段中 但在形成重组分子时往往是依赖于DNA复制而 完成重组过程 eg 转座作用 需要转座酶和对转座区域 DNA的复制 2 位点专一性重组 重组依赖于小范围同源序列的联会 发生精确的断裂 连 接 DNA分子并不对等交换 eg phage DNA对E coli 的整合 attP attB 需要有15 bp 的同源序列和专一性的蛋白质因子参与 位点专一重组发 生在两条特定的 序列 两条重组 DNA的其他序列 则是不同的 位点专一重组能使二聚体环状DNA分子产生两 个单体环状DNA分子 6
4、2 同源重组的分子机制 同源重组 homologous recombination 发生在两个同源 DNA分子之间 真核细胞减数分裂过程中 同源染色体彼此 配对 同源染色体DNA片段发生交叉与互换 Darlington D C 于1936年提出 减数分裂同源染色体联会时 非姊妹染色单体由于缠绕而产生张力 两个染色单体在同一 位置断裂 重接 以消除张力 从而产生重组 6 2 1 断裂与重接模型 First Meiotic Interphase cells contain 4N DNA content Bivalent sister chromatids align with each other
5、 this act is termed synapsis Synapsed sister chromatids are termed a synaptonemal complex Figure 5 55 page 185 两条同源DNA分子彼此并排对齐 相互配对DNA中两个 方向相同的单链在DNA内切酶的作用下 在相同位置上 同时切开 在切口处发生链的交换 形成所谓的连接 分子 joint molecule 也称Holliday结构 Holliday structure 分支点可以发生移动 称为分支迁移 branch migration 分支迁移的结果是在两个DNA分子中形 成异源双链区 he
6、teroduplex 1 Holliday model Synapsed chromatids Recombination joint Heteroduplex DNA 链交换所形成的连接分子必须进行拆分 才能形成 两个独立的双链分子 这需要再产生两个切口 反应结果要看切开的是哪一 对链 如果切口发生在当初未切的两条链上 那么原 来的4个链就全被切开 就会释放出剪接重组 DNA splice recombinant DNA 分子 A B B A A B A B A B B A Holliday intermediates A B B A A B A B A B A B Endonuclease
7、s aka resolvases e g RuvC Products before DNA repair Holliday Intermediate see Photo in Lehninger pg 962 如果切口发生在当初被切的两条链上 连接分子 拆分后将形成补丁重组体 patch recombinant 分开的两个DNA分子除保留了一段异源双链DNA 外 均完整无缺 因此 连接DNA分子无论如何拆分 所形成的两个 独立的DNA分子总有一段异源双链区 但是异源双 链区两侧的重组未必同时发生 Termed patch recombinants 两条双链体DNA分子间的重组关键是单链的交换
8、当双链体DNA的单链与相对应的另一双链体中的单 链发生置换时 会产生一个分叉结构 交换产生异源双链体DNA片断 两条单链分别来自 父本和母本 联合分子可以通过切开相接的链从而形成两条分开 的双链体分子 DNA双链体配对 同源链被切出缺口 在双链体之间 断裂链交换 靠分叉迁移 使交叉点移动 在双链体间第二链交叉 切口被封闭 两条配对双链体DNA的重组 包括相互的单链交换 分叉 交换和缺口的切出 Holliday模型 nHolliday R 于1964年提出 旋转显示Holliday接头结构 切口控制结果 根据链被切出缺口的位置 Holliday 结构的结果可产生亲本双链体或重 组双链体 两种类型
9、的产物都有一段 异源双链体DNA n Holliday模型能够较好解释同源重组现象 但也 存在问题 该模型认为进行重组的两个DNA分子在 开始时需要在对应链相同位置上发生断裂 DNA分 子单链断裂是经常发生的事 但很难设想两个分 子何以能在同一位置发生断裂 6 2 3 Meselson Radding模型 l Holliday模型中为对称的杂合双链 而实际情况有不均 等分离现象 l1975年 Matthew Meselson 和 Charles Radding对 Holliday 模型进行了修改 nHolliday模型要求在两个并排对齐的同源DNA分子的对应 位点形成单链切口 从而产生游离的单
10、链末端 然而 在 Meselson Radding遗传重组模型中 仅在一个双螺旋上 产生单链切口 利用切口处3 OH合成的新链把原有的链 逐步置换出来 使之成为以5 P为末端的单链区 随后 游离的DNA单链侵入另一条DNA双螺旋中 取代它的同源 单链并与其互补链配对形成异源双链区 被置换的单链形 成D 环 D loop nD 环单链区随后被切除 两个DNA分子在DNA连接酶的作 用下形成Holliday交叉 与Holliday不同 此时只在一条 DNA分子上出现异源双链区 如果发生分支迁移 在两条 双螺旋上均出现异源双链区 随后发生的连接分子的拆解 与Holliday模型一样 n但是更多的事实
11、表明 重组是由双链断裂所启动 现在认为 同源重组是减数分裂的原因 而不 是减数分裂的结果 DNA分子双链断裂才能与同 源分子发生链的交换 藉以将同源染色体分配到 子代细胞中去 因此 双链断裂启动重组 也启 动了减数分裂 6 2 4 双链断裂重组模型 model of double strand breaks recombination n一条染色体的两条链都发生了断裂 断裂是由内切酶水解 磷酸二酯键的结果 nDNA断裂之后由核酸外切酶扩大缺口 接着是断裂链的游 离3 端插入到具有完整双链的同源染色体中 形成D 环结 构 n在DNA聚合酶的作用下 断裂两条链分别以完整链为模板 开始合成 最后再通
12、过断裂重接过程完成重组 在受体中形成双链断裂 断裂扩大为含有3 端的间隙 3 端转到其他的双链体上 3 端的合成替换了间隙的一条链 置换的链迁移到其他双链体上 DNA的合成发生于其他3 端 间隙被供体序列替代 相互移动产生了双交换 6 3 重组和酶 n在原核生物同源重组中存在8个碱基组成的 Chi位点 重组热点 5 GCTGGTGG 3 3 CGACCACC 5 在E coli中每隔约5 10 kb有一个拷贝 nRec和Ruv蛋白参与重组 RecA蛋白 nRecA具有单链DNA和双链DNA的结合活性 能启动DNA单链和与之互补的双链分子 进行碱基配对 催化单链取代 n RecA能促进SOS反应
13、中的蛋白酶活性 单链取代 single strand uptake n其中一个DNA 分子要有单链区 n其中一个DNA 分子要有游离的3 末端 n单链区和3 末端可和另一DNA分子互补 RecA具有的处理DNA活性使一条单链能与一条双链 体中的同源部分发生置换 这个反应称为单链同化 这个 置换反应可发生在几种不同构型的DNA分子之间 但要具 备3个条件 在双链体与单链分子之间RecA催化链交换 只要其中的一条反应链有游离端 RecA就能促进入侵的 单链同化于双链体DNA中 RecA蛋白介导的DNA链交换模型 nRecBCD复合体具有核酸酶 解旋酶和ATPase活性 n在Chi位点产生单链3 游
14、离未端 nChi位点能够改变RecBCD的酶活性 一旦RecBCD识别 出Chi序列 RecBCD核酸酶活性便发生变化 其3 5 外 切酶活性受到抑制 5 3 外切酶活性被激活 由原来优 先降解3 末端链 改变为只降解5 末端链 但是它的解旋 酶活性未受到影响 nRecBCD酶活性变化的结果是产生3 末端带有Chi位点的 ssDNA RecBCD蛋白 RecBCD核酸酶从一边开始 向chi位点前进 当它前进时 它降解DNA 在chi位点 它进 行核酸内切 而后失去RecD 并保留解旋酶活性 nRuvA可识别 Holliday的连接点结构 nRuvB是ATPase 可发动迁移反应 nRuvC是一
15、种内切酶 可特异识别Holliday分枝 它在体外可切这个连接体 解离重组中间体 Ruv 蛋白 RuvAB是个不对称的复合体 它推进Holliday结合点的分叉迁移 损伤DNA的复制产生间隙 RecA介导链交换 第二链交换 间隙由DNA合成来填补 RuvAB介导分叉迁移 RuvC切除Holliday连接点 6 4 位点特异性重组 n位点特异性重组是发生在DNA上特定序列之 间的重组 不依赖于DNA顺序的同源性 由 能识别特异DNA序列的蛋白质介导 并不需 要RecA蛋白和单链DNA 6 4 位点特异性重组 n 噬菌体DNA侵入大肠杆菌细胞后 面临着裂解生长和溶原生长 的选择 要进入溶原状态 游
16、离的 噬菌体DNA要插入到宿主的 染色体DNA中去 这个过程称为整合 integration 由溶原生 长进入裂解生长 DNA又必须从宿主染色体上切除下来 这个 过程称为外切 excision n整合和外切 均需要通过细菌DNA和 DNA特定位点之间的重组来 实现 这些位点称为att位点 attachment site n 噬菌体的int编码整和酶来催化整和反应 位点专一性重组的核苷酸序列 n1 POP O为15bp 核心 富含A T的非对称序列 P为 160 0的160bp序列 P 为0 80的80bp序列 n2 BOB B为 11 0序列 B 为0 11序列 噬菌体的整合和切除 共240bp 共23bp 通过在attB和attP之间的 相互重组 噬菌体环状 DNA转变成线性的前噬菌 体 而通过在attL和attR 之间的相互重组 前噬菌 体能被外切出来 n DNA对E coli的整合 POP BOB BOP POB 需要整合酶 Int 拓扑异构酶活性 和整合宿主因子 IHF 参与 n DNA从E coli的切离 BOP POB POP BOB n需要整合酶 Int 整合宿主因子 I
