《融合蛋白表达载体构建相关设计和质粒提取和分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《融合蛋白表达载体构建相关设计和质粒提取和分析（65页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、课程内容安排课程内容安排 一 融合蛋白一 融合蛋白 表达载体构建的设计与质粒提取及分析表达载体构建的设计与质粒提取及分析 n n 实验课有关要求及注意事项实验课有关要求及注意事项 n n 分子生物学实验有关基础知识及操作 微量操作 移液器及分子生物学实验有关基础知识及操作 微量操作 移液器及 酶的使用 称量 制板 灭菌等 酶的使用 称量 制板 灭菌等 n n 基因克隆的原理基因克隆的原理 n n 蛋白表达载体的构建蛋白表达载体的构建 n n 细菌培养 液体和固体 细菌培养 液体和固体 n n 质粒质粒DNADNA的提取及定量分析的提取及定量分析 二 重组质粒的构建二 重组质粒的构建 n n D
2、NADNA酶切 电泳 纯化 讲解酶切 电泳 纯化 讲解PCRPCR产物纯化 产物纯化 n n DNADNA的体外连接的体外连接 三 细胞转化三 细胞转化 n n 感受态细胞的制备及转化 感受态细胞的制备及转化 CaCl2CaCl2法 提前过夜摇菌 法 提前过夜摇菌 四 重组质粒的鉴定 四 重组质粒的鉴定 PCRPCR法 法 n n 提前转板过夜提前转板过夜 n n PCRPCR原理 反应条件及原理 反应条件及PCRPCR引物设计 软件操作 引物设计 软件操作 n n 重组转化子的鉴定重组转化子的鉴定 PCR PCR法 介绍法 介绍Cracking gelCracking gel等方法 等方法
3、n n 重组转化者的保存 重组转化者的保存 70 70 五 体外重组蛋白表达及分析五 体外重组蛋白表达及分析 n n 提前提前IPTGIPTG诱导诱导 n n SDS PAGESDS PAGE胶胶 n n Brand ford Brand ford 蛋白定量分析蛋白定量分析 n n 蛋白纯化及活性测定蛋白纯化及活性测定 六 总六 总RNARNA的提取及测定的提取及测定 n n 组织总组织总RNARNA的提取 变性胶鉴定的提取 变性胶鉴定 n n 讲解讲解RT PCRRT PCR 七 基因组七 基因组DNADNA的提取及鉴定的提取及鉴定 n n 基因组基因组DNADNA的提取及鉴定的提取及鉴定
4、n n 基因组和基因组和cDNA PCRcDNA PCR 基因结构分析 基因结构分析 八 基因的蛋白水平表达检测 八 基因的蛋白水平表达检测 Western blotWestern blot n n Western blotWestern blot n n 基因组基因组DNADNA酶切胶检测酶切胶检测 n n 总复习 总结总复习 总结 实验一 融合蛋白表达载体构建的设计实验一 融合蛋白表达载体构建的设计 与质粒提取分析与质粒提取分析 n n 第一部分 分子实验相关知识第一部分 分子实验相关知识 Part IPart I 实验课有关要求及注意事项实验课有关要求及注意事项 Part IIPart
5、II 分子生物学实验有关基础操作分子生物学实验有关基础操作 Part IIIPart III 基因克隆的原理 基因克隆的原理 Part IVPart IV 蛋白表达载体的构建蛋白表达载体的构建 n n 第二部分 质粒第二部分 质粒DNADNA的提取及定量分析的提取及定量分析 Part IPart I 质粒质粒DNADNA提取的原理提取的原理 Part IIPart II 方法步骤方法步骤 Part IIIPart III 结果与分析结果与分析 分子生物学实验室一般安全知识分子生物学实验室一般安全知识 n n 不能在实验室吸烟 或吃喝东西 不能在实验室吸烟 或吃喝东西 n n 当使用危险或潜在危
6、险物质时 请穿上工作服 戴上手套当使用危险或潜在危险物质时 请穿上工作服 戴上手套 保护眼镜和口罩 保护眼镜和口罩 n n 请记住 使用请记住 使用EBEB 酚 酚等危险物质时 必须戴手套 等危险物质时 必须戴手套 并且应并且应 该经常水洗手套的外围 以免污染仪器等 当你离开实验该经常水洗手套的外围 以免污染仪器等 当你离开实验 室时 务必脱掉手套方可离去 使用同位素及酚时 建议室时 务必脱掉手套方可离去 使用同位素及酚时 建议 戴两层手套 戴两层手套 n n 废物的处理废物的处理 废液 强酸及强碱废液 强酸及强碱 须稀释 等液体可以倒 须稀释 等液体可以倒 入水槽 并放水冲走 入水槽 并放水
7、冲走 废纸废纸等固体废物应倒入垃圾桶 废等固体废物应倒入垃圾桶 废 弃的弃的微生物微生物以及培养它们的朔料枪头及管必须倒在指定桶以及培养它们的朔料枪头及管必须倒在指定桶 内以备消毒 培养基以及盛其容器必须高压消毒后方可作内以备消毒 培养基以及盛其容器必须高压消毒后方可作 普通物品处理 普通物品处理 同位素同位素实验的废液及物品 则分别倒在同实验的废液及物品 则分别倒在同 位素室里指定的容器里 位素室里指定的容器里 EBEB胶胶倒在指定桶内 倒在指定桶内 酚及氯仿酚及氯仿及及 盛它们的管分别倒在化学通风厨内的容器内 盛它们的管分别倒在化学通风厨内的容器内 破碎的玻璃破碎的玻璃 制品制品必须倒在特
8、定的桶内 必须倒在特定的桶内 n n 当你使用当你使用紫外分析仪紫外分析仪时 应戴上防紫外线的眼镜 如果用时 应戴上防紫外线的眼镜 如果用 它来切胶 请戴上面罩 它来切胶 请戴上面罩 n n 同位素实验同位素实验必须在同位素室进行 不得随意将同位素室里必须在同位素室进行 不得随意将同位素室里 的任何仪器搬出来 完成同位素实验后 必须用仪器测定的任何仪器搬出来 完成同位素实验后 必须用仪器测定 所用物品 桌面及手套等 所用物品 桌面及手套等 肯定没有污染后方可离开同位肯定没有污染后方可离开同位 素室 素室 n n 如果洒了化学 生物等危险物质 把那区域作一记号 并如果洒了化学 生物等危险物质 把
9、那区域作一记号 并 马上汇报老师 作相应的处理 一般的药品溅出 应马上马上汇报老师 作相应的处理 一般的药品溅出 应马上 用吸水纸清洁干净 用吸水纸清洁干净 n n 如化学物品溅到皮肤等 应马上用水冲洗 如轻微割伤并如化学物品溅到皮肤等 应马上用水冲洗 如轻微割伤并 没感染的话 可用红十字药盒里的止血贴 否则 马上送没感染的话 可用红十字药盒里的止血贴 否则 马上送 医院 任何事故应马上报告老师 医院 任何事故应马上报告老师 n n 量程 量程 n n 0 50 5 10 l 10 l 读读数窗数窗显显示示0 50 5 10 0 10 0 精度精度为为0 1 l 0 1 l n n 5 5 5
10、0 l 50 l 读读数窗数窗显显示示5 05 0 50 0 50 0 精度精度为为0 5 l 0 5 l n n 2020 200 l 200 l 读读数窗数窗显显示示2020 200 200 精度精度为为1 l 1 l n n 100100 1000 l 1000 l 读读数窗数窗显显示示100100 1000 1000 精度精度为为 5 l 5 l 安装吸头安装吸头 n n 使用量程配套的吸头使用量程配套的吸头 n n 将枪嘴垂直插入吸头盒的吸头上将枪嘴垂直插入吸头盒的吸头上 n n 轻轻用力向下压 同时把手中的移液器按顺时针轻轻用力向下压 同时把手中的移液器按顺时针 方向旋转方向旋转1
11、80180 使吸头紧紧地扣在枪嘴上 使吸头紧紧地扣在枪嘴上 移液操作移液操作 n n 一手拿住枪 另一手旋转转来设置你所要的容量 一手拿住枪 另一手旋转转来设置你所要的容量 n n 把合适的枪头插入枪的末端 并轻微旋转一下 把合适的枪头插入枪的末端 并轻微旋转一下 n n 把活动杆压下一档 这让枪定下你所要的容量 把活动杆压下一档 这让枪定下你所要的容量 n n 把枪头直伸入液体约把枪头直伸入液体约2 5mm2 5mm深处深处 如果深入过深 如果深入过深 将使枪头的外围粘上液体而导致取液的误差 将使枪头的外围粘上液体而导致取液的误差 n n 让活动杆让活动杆慢慢地慢慢地回到原始位置 否者 过快
12、产生的回到原始位置 否者 过快产生的 气雾将污染枪管和你的溶液 气雾将污染枪管和你的溶液 n n 让枪头在液中停一会 以便使液体完全进入枪头 让枪头在液中停一会 以便使液体完全进入枪头 如果枪头从液中移开太快 可能会有空气在枪头中如果枪头从液中移开太快 可能会有空气在枪头中 应目测是否有 应目测是否有气泡气泡或者或者所取的量所取的量是否符合你的要是否符合你的要 求 求 n n 把枪头贴在液面附近的管壁或管底 然后把液体把枪头贴在液面附近的管壁或管底 然后把液体 放出 须检查是否还有液体在枪头中 如是 慢慢放出 须检查是否还有液体在枪头中 如是 慢慢 把液体放入管中 把液体放入管中 n n 把枪
13、头去掉 扭回最大量程处 把枪头去掉 扭回最大量程处 移液操作移液操作tipstips n n 吸酶或母液时 永远用新的干净的枪头 如果不幸污染了酶 请报告吸酶或母液时 永远用新的干净的枪头 如果不幸污染了酶 请报告 老师 即使是稀释一梯度溶液 如要求很严格的体积 也必须使用新老师 即使是稀释一梯度溶液 如要求很严格的体积 也必须使用新 的头 的头 n n 检测是否漏气的方法 将吸取液体后的移液器垂直静置检测是否漏气的方法 将吸取液体后的移液器垂直静置 15 15 秒 观察秒 观察 是否有液滴缓慢是否有液滴缓慢 的流出 若有流出 说明有漏气现象 的流出 若有流出 说明有漏气现象 n n 严禁严禁
14、吸液后将移液器吸液后将移液器平放平放 n n 对于粘稠液体可首先吸放几次 然后极缓慢地松开按钮 使溶液慢慢对于粘稠液体可首先吸放几次 然后极缓慢地松开按钮 使溶液慢慢 进入吸头内 否则 可使吸入体积减少 进入吸头内 否则 可使吸入体积减少 移液器的校正移液器的校正 n n 在在2525 时时 水的密度大 水的密度大约为约为 1g ml 1g ml mg ulmg ul n n 如要校正如要校正2 20ul 2 20ul 移液器 取移液器 取1010和和20ul20ul水于分析天平上分水于分析天平上分别别 称三次 称三次 n n 如要校正如要校正20 200ul 20 200ul 移液器 移液器
15、 测测量量100100和和200ul200ul的水 的水 n n 如要校正如要校正100 1000ul 100 1000ul 移液器 移液器 测测量量500500和和1000ul1000ul的水 的水 n n 如果你的移液器如果你的移液器误误差超差超过过了了5 5 请请通知老通知老师师 离心管的使用离心管的使用 n n 手持离心管时注意手持离心管时注意不要触碰离心管内表面不要触碰离心管内表面 包括盖子内表面 包括盖子内表面 n n 实验中加入任何试剂后应注意样品的实验中加入任何试剂后应注意样品的混匀混匀 n n 混匀 保温等反应后样品应混匀 保温等反应后样品应瞬时离心将内容瞬时离心将内容 物收
16、集至管底物收集至管底后再进行下步的实验 后再进行下步的实验 n n 实验过程中应做好每个实验过程中应做好每个样品的标记样品的标记工作 且工作 且 一般在离心管上用记号笔作标记时 应在两一般在离心管上用记号笔作标记时 应在两 处重复做好标记 处重复做好标记 基因克隆 基因克隆 DNADNA重组 重组 n n 克克 隆 隆 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合 n n 克隆化克隆化 获取同一拷贝的过程 获取同一拷贝的过程 n n DNADNA克隆 分子克隆 基因克隆 重组克隆 分子克隆 基因克隆 重组DNA DNA 应用酶学方法 在体外将外源性遗传性物质 应用酶学方法 在体外将外源性遗传性物质 DNADNA 与 与 载体结合成载体结合成重组重组DNADNA分子分子 继而通过 继而通过转化或转染转化或转染宿主细宿主细 胞 胞 筛选筛选出含有目的基因的转化子细胞 再进行扩增 提出含有目的基因的转化子细胞 再进行扩增 提 取取获得大量同一获得大量同一DNADNA分子的过程 分子的过程 工具酶 工具酶 功 能 n限制性核酸内切酶 识别特异序列 切割DNA nDNA
