DNA复制工作

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1、第十章 DNA复制 DNA是遗传信息分子 分子中特定的核苷酸 顺序决定着生物体的遗传特征 一个母细胞在分裂为两个子细胞之前 母 细胞中的DNA必须忠实地被复制 通过复制把 亲代的遗传信息传递给子代 从而使子代表 现出亲代的遗传性状 DNA复制是在DNA聚合酶催化下进行脱氧核 苷酸聚合反应 整个基因组被复制的过程 DNA聚合酶都是以4种脱氧核苷三磷酸dNTP dATP dGTP dCTP dTTP 作为底物 单链DNA为模板合成一条 互补的 反平行链的酶 由于需要DNA作为模板 这样的 酶叫做DNA指导的DNA聚合酶 简称为DNA聚合酶 DNA聚合酶催化反应涉及生长着的DNA链的3 OH对底 物

2、脱氧核苷三磷酸 dNTP 的 磷酸进行亲核攻击 形 成磷酸酯键 同时释放出焦磷酸 焦磷酸进一步被焦磷酸 酶水解释放能量驱动聚合反应的进行 结果在3 末端加 上了一个新的脱氧核苷酸 链由5 3 方向延伸 10 1 DNA复制方式 Meselson Stahl实验 1 使E coli 大肠杆菌 在含有唯一氮源15 15NH NH 4 4 C Cl l的培养 基中培养 很多代后合成的所有核苷酸都含有15N 2 将生长在15NH4Cl培养基的E coli转移到含有唯一氮源 1414NH NH 4 4 ClCl 的培养基中培养 培养两代 取每一代的DNA进行CsCI密度梯度离心 1 半保留复制 密度梯度

3、离心 首先在15 15NH NH 4 4 ClCl培养基中培养 然后转到14 14NH NH 4 4 ClCl培养基中培养 只在 1515NH NH 4 4 Cl Cl 中培养 只在 1414NH NH 4 4 Cl Cl 中培养 1414N N对照系统 对照系统 1515N N对照系统 对照系统 第一代第二代 提取DNA 进行密度梯度超离心 E coli 细胞 1515N N标记的亲 本DNA 1414N N中第一 次复制 1414N N中第二次复制 半保留复制 第 一 代 第 二 代 DNA的半保留复制的生物学意义 DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性 按 半保留复制方式 子代DN

4、A与亲代DNA的碱基序 列一致 即子代保留了亲代的全部遗传信息 体 现了遗传的保守性 是物种稳定性的分子基础 DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质 在细胞 内外各种物化因子均可导致DNA损伤 需要修复 在复制 和转录过程中DNA会发生损耗 必须进行更新 在发育和 进化过程中DNA可能进行修饰 删除 扩增和重排 在进 化的角度上 DNA更是处在不断的变异和发展中 复制起点 方向和方式 原核生物染色体DNA 或真核生物的细胞器DNA 单复制起点 即整个染色体只有一个复制单位 真核生物染色体DNA 多复制起点 一个genome中有多个复制单位 复制起点 origin 或ori 复制开始处

5、DNA的特定位置 复制子 Replicon 复制单位 从一个起点到一个 终点所包含的DNA区域 是基因组独立进行复制的单位 许多生物的复制起点都是富含A T的区段 l复制子 Replicon 基因组中能独立进行复制的单 位 每个复制子都含有一个复制起点 l原核生物的染色体和质粒 真核生物的细胞器DNA是 环状双链分子 它们都只有一个固定的复制起点 都是单复制子 l真核生物染色体DNA是线形双链分子 有多个复制起 点 是多复制子 每个复制子约有100 200Kbp 人 体细胞平均每个染色体含有1000个复制子 l病毒DNA多种多样 环状或线形 双链或单链 但都 是单复制子 l许多生物的复制起点都

6、是富含A T的区段 2 双向复制 在含有低剂量3H标记的胸腺嘧啶核苷的培养基中培养大 肠杆菌 使DNA具有放射性 观察标记 发现环形染色体 复制形成一个 e ta 表明两条链同时复制同时复制 如果短暂暴露在高水平的3H标记的胸腺嘧啶核苷 通 过放射自显影观察标记 如是单向复制 应当 只出现一个被标记的 复制叉复制叉 如果是双向复制 双向复制 应 当出现两个两个被标记的 复制叉复制叉 放射自显影表明双向复制 单向还是双向复制 3 半不连续复制 DNA两条链是反向平行缠绕在一起的 一条链为5 3 方向 另一条链为3 5 方向 DNA聚合酶只能催化以3 5 链为 模板 按照5 3 方向的聚合反应 显

7、然对于复制叉移动方向 为3 5 的模板链 DNA聚合酶可以沿5 3 方向连续合成其 中的一条子代DNA链 但对于复制叉移动方向为5 3 的模板 链 DNA聚合酶如何合成它的子代DNA链的呢 1968年 冈崎等用大肠杆菌为实验材料 使用含有3H标记的 胸苷的培养基培养几秒钟后 然后杀死细菌 分离DNA 测定 新合成的DNA放射性 发现核素出现在长度为1000 2000个核 苷酸残基的片段上 后来称为冈崎片段 真核生物中 冈崎片 段长度为100 200个核苷酸残基 如果培养时间延长到1或2 分钟 核素则出现在大的DNA片段上了 半不连续复制模型 复制叉移动方向为3 5 的模板链 按照5 3 方向被

8、连续 合成 该连续合成的子链称为前导链 复制叉移动方向为 5 3 的模板链 只能在复制叉移动暴露出后 先合成一些不连 续的冈崎片段 然后通过DNA连接酶再将这些片段连接成一条链 通过不连续合成方式合成的子链称为后随链 两条子代链都是沿照5 3 方向合成 前导链被 连续合成 后随链被不连续合成 在大肠杆菌中 DNA聚合酶III全酶是DNA复制中主要的 酶 DNA复制是在DNA聚合酶III全酶复合物催化下完成的 复合物中的两个DNA聚合酶III全酶分别执行前导链和后随链 的合成 前导链应当先于后随链的合成 10 2 DNA聚合酶 Arthur Kornberg 斯坦福 大学教授 等人 于1956年

9、在 大肠杆菌的提取液中发现了 DNA聚合酶 polymerase Pol 10 2 DNA聚合酶 Arthur Kornberg发现的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶 I Pol I 具有5 3 方向聚合酶活性聚合酶活性 3 3 5 5 外切酶外切酶活性 和5 3 外切酶活性 DNA合成时 在DNADNA聚合酶聚合酶催化下 脱氧核苷酸加到 一个延伸的DNA链上 需要一条DNA链作为模板 这样的 酶也叫做DNA指导的DNA聚合酶 DNA聚合酶 I 聚合酶活性 dNMP n dNTP dNMP n 1 PPi 催化需要两个条件 DNA模板和带有带有3 3 OH OH的引物 RNA DNA聚合酶

10、I的3 5 外切酶活性 3 5 外切酶活性 即从3 端向5 方向切 可以将错配的 脱氧核苷酸切去 再将正确配对的脱氧核苷酸填上 这一功 能对于DNA合成非常重要 一个 和 可形成核心聚合酶 两个核心聚合酶通过 亚基二 聚体与另外5个亚基构成的六聚体 复合物 2 缔合形 成一个总共14个亚基 9种亚基 的聚集体 称为DNA聚合酶III 然 后DNA聚合酶III中每个核心聚合酶各与一个 亚基二聚体结合形成 DNA聚合酶III全酶复合物 复合物中包括两个DNA聚合酶III全酶 tau epsilon 岗崎岗崎 片段片段 复制叉移动方向 前导链 滞后链 DNA聚合酶III同时催化两条链的合成 10 3

11、 DNA 复制 DNA复制过程和酶催化反应机制在各种生物中基本相同 DNA复制分为复制起始 DNA片段合成与延伸 终止 E coli DNA复制开始于唯一的一个由245bp构成 oriC 该区域富含A T 碱基对 大约20个起始因子DnaA蛋白与oriC区结合引起该部分 DNA结构发生变化 DnaB蛋白 解旋酶 在DnaC蛋白的协 助下结合在起点处 依赖于ATP水解从起点向两个方向使模板 双螺旋DNA解旋 形成两个复制叉 一旦解旋变成单链DNA立刻被单链结合蛋白 SSB 结合 防止两个互补单链重新形成双螺旋 解旋酶DnaB使DNA双链解旋的同时 解旋作用会产生正 超螺旋 但在复制叉处的连续解旋

12、导致的扭转张力 需要 DNA回旋酶作用产生额外的负超螺旋予以抵消 1 复制起始 DNA回旋酶和解旋酶DnaB使DNA双链解开 被解开的 DNA单链区与SSB结合维持着单链状态 2 延伸 前导链的合成和滞后链的合成 合成方向与复制叉移动的方向一致的子链称为前导链 合成方向与复制叉移动方向相反的另一条子链称为滞后 链 亲代DNA被DNA解旋酶解旋 分开的每一条链被单 链结合蛋白 SSB 稳定 防止重新形成双螺旋 双链解离成单链后 开始了过程截然不同的前导链和 滞后链合成 1 RNA引物合成 当DNA模板暴露出来以后 由于DNA聚合酶III不能从 头合成 所以无论是前导链 还是滞后链合成都需要一个

13、带有3 羟基的引物 引物是RNA 引发体中的引发酶以DNA模板合成一段 与DNA互补的RNA片段 有了RNA引物 DNA聚合酶III开始合成新的DNA链 可以说RNA启动了DNA的合成 2 前导链和滞后链的合成 a 前导链合成 由引发酶在复制起点合成一段一段RNARNA引物引物 DNA聚合酶 III以3 5 链作为模板连续合成连续合成它的5 3 互补链 前导链 b 滞后链的合成 不连续合成不连续合成 滞后链合成方向与复制叉移动方向滞后链合成方向与复制叉移动方向相反相反 滞后链的合 成是先合成许多冈崎片段 然后连成大的DNA片段 在合 成冈崎片段之前都需要先合成RNA引物 前导链连续合成 滞后链

14、不连续合成 前导链合成只 需要合成一次RNA引物 滞后链合成需要很多RNA引物 E coli 引发酶每秒钟可合成10个核苷酸的RNA引物 复制叉移动速度每秒约为1 000个核苷酸 每1 000个核苷 酸就要合成一个RNA引物 在DNA聚合酶 催化下由RNA引物3 端OH合成岗崎 片段 合成的冈崎片段在连接成大的DNA片段的任务由DNA 聚合酶I和DNA连接酶完成 DNA 聚合酶 I 利用 5 3 外切酶活性切去RNA引物 出现一个切口 再利用本身的5 5 3 3 聚合酶活性聚合酶活性按照 DNA模板合成非模板链 实际上就是3 方向平移切口 这 一过程称为切口平移 切口平移至相邻冈崎片段的5 磷

15、酸 端 在DNA连接酶催化下 一个岗崎片段的3 OH末端和 另一个岗崎片段的5 磷酸基团之间形成一个磷酸二酯键 将两个岗崎片段连接起来 将两个岗崎片段连接起来 3 终止 两个反向复制叉在ter区相遇 复制便被终止 终止于oriC 对面的终止区 ter 内 ter区内含有一些短的DNA序列 terA terG 它们含有共有的核心序列5 GTGTGTTGT 3 起着终止复制的作用 被称为终止子 终止子分为两组 1 顺时针方向的复制叉终止子 由 terC terB terF和terG构成 负责终止顺时针方向的复制叉 移动 2 逆时针方向的复制叉终止子 由terA terD和terE 构成 负责终止逆

16、时针方向的复制叉移动 大肠杆菌中的ter区组织 ter区含有7个非对称的ter部位 每个都可与终止子利用物质Tus结合 ter发挥使复制叉停止的功能还需要终止子利用物质 Tus Tus是抗解旋酶 能够特异地与ter结合 通过抑制DnaB解 旋酶活性 防止DNA双螺旋解旋 阻止复制叉前进 一旦复制叉遇到Tus ter复合物 复制便停止 来自另一个 方向的复制叉遇到已停止的复制叉时复制也随之停止 最终完 成两个双螺旋的合成 在整个染色体被复制后 两个环状的双螺旋DNA分子从拓 扑学上看 像一个连环那样链套在一起 然后连接的两个染色 体经DNA拓扑异构酶 催化分开 在细胞分裂时分别进入两个 子代细胞 真核生物染色体一般都比细菌染色体大得多 虽然染色 体数目的增加使得基因组更复杂 但所有生物中的DNA复制 的生物化学机制基本上是类似的 前导链的合成是连续的 而 后随链的合成是不连续的 引物合成 冈崎片段合成 RNA引 物水解后填充与模板链互补的核苷酸等所有的过程都类似 真 核生物DNA复制还有以下一些特点 真核生物所含的DNA聚合酶种类更多些 至少19种 真核生物复制叉处需要的辅助蛋白不同 真