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1、. . . .超速离心技术超速离心技术是利用物质的沉降系数、浮力、质量等方面的差异，利用强大的离心力场，使样品中的混合物得以分离、浓缩、纯化和鉴定的技术。离心技术现在已经成为分子生物学和生物化学研究中不可缺少的一项重要技术。离心技术可分为制备型和分析型两类。在生物学领域可以利用这种方法，分离提取各种细胞及其亚细胞物质，如细胞膜、细胞核、染色体、线粒体、叶绿体、溶酶体、核蛋白体等。也可以鉴定蛋白质、酶及核酸的纯度。处理的样品可多可少，少至0.2mL以下。离心技术的范围相当广泛。目前，利用这种技术分离各种亚细胞物质、酶、病毒、质粒及各种核酸。因此，为分子生物学、生物化学和医学的发展，提供了有利的手
2、段。自从1926年瑞典物理学家Svedberg制成世界上第一台超速离心机（45000转/分）到现在已有快80年的历史，在这期间，离心机的发展是非常迅速的。特别是在50年代以后发展的更快，例如，美国贝克曼（Beckman）公司和杜邦苏凡尔（Dupont Sorvall）公司，英国测量科学设备公司（MSE），日本的日立（HITACHI）公司以及德国的海吕斯（Heraeus）公司，都生产出各种离心机产品，如普通离心机、高速离心机和超速离心机。从简单的低速高容量的制备离心机到用于精密分析的超速离心机，应有尽有。美国贝克（Beckman）公司的超速离心机居世界领先地位，采用了大规模集成电路，计算机程序控
3、制，分离-检测，全部实现自动化；最高转速可达13多万转/分钟，并配有各种型号的垂直转头、水平转头、固定角转头、区带转头、连续转头等，供用户选用，不但操作简单、节省时间，而且进一步提高了的分离效率。此外，离心技术也有了很大的发展，有密度梯度离心技术和区带离心技术，为生物大分子的分离、纯化和鉴定提供了优越的手段。虽然离心机的种类有多种，离心技术也多种多样，但是它们的工作原理基本相似。在实际工作中用的最多的还是制备型离心。本课程主要介绍制备型分离技术。一、离心原理离心技术是根据物质在离心力场中不同的行为来分离物质的。任何物体，当它做圆周运动时，都要经受一个向外的离心力（F）。离心力的大小，取决于离心
4、转头的角速度（w，单位弧度/秒），和物质颗粒距离心轴的距离（r，单位厘米）。因此，离心力与角速度和距离的关系用方程式F=w2r表示。（一）离心力离心力（F）常用地心引力来表示。这时它指的是相对离心力（relative centrifugal force, RCF）。RCF又常以重力常数（g, 980厘米/秒2）的倍数来表示，所以：为了使用方便，须用离心机的转数（即转数/分，以rpm表示，即revolutions per minute）来表达这个系数，可将弧度变成转速：因此从上式可知，只要知道离心机的rpm有离心管中某物质颗粒到离心转轴的中心垂直距离r，就能够计算这个颗粒所受的离心力。例如，一个
5、离心转头，最大半径为9cm，转速为18000转/分，求离心转头最大离心力和最大相对离心力。r = 9 cmw = 2p18000rpm = 2 3.1416 18000 转/60秒 = 185 秒-1 最大离心力 = w2r = （1885秒-1）2 9厘米 = 31979025 厘米/秒2 即相当于重力的32632倍，在这种条件下离心，样品沉降速度比重力场要大32632倍。通常，超速离心时，用g来表示，在低速离心时，则用rpm表示。为了知道转速（rpm）、旋转半径（r）离心管液柱中间到旋转轴中心的距离和离心力（单位为g）的关系，根据上面的方程式，Dole 和 Cotzias 制作了与转头速度
6、和半径相对应的RCF的列线图（表1-1）。（二）沉降系数在离心力场作用下，物质颗粒以一定的速度向离心管底部移动，这个移动的速度可用下公式表示：v 为沉降速度。沉降速度与离心力场成正比，这一比例常数就是沉降系数。用S表示。所谓沉降系数，就是在单位离心力场中颗粒沉降的速度。S的单位是秒，因为许多生物大分子的S值很小，所以定义10-13秒为一个沉降系数的单位。为了纪念超离心分析的创始入Svedberg，就把10-13秒这个数量级定为一个Svedberg单位，用S表示。为了使沉降系数只表示样品本身的物理量，所以又规定了在20C的纯水中所测得样品的沉降系数，并用S20,w表示，右下角的20表示温度，w表
7、示纯水。由于许多生物大分子的沉降系数表现了浓度的依赖性，所以用浓度接近零的外推值来表示生物大分子的沉降系数，即S020,w，右上角的零表示浓度为零。例如，溶菌酶的沉降系数为2.1510-13秒，通常就叫做2.15S。过氧化氢酶的沉降系数为11.3510-13秒，就称11.35S。大肠杆菌核蛋白体是70S，它是由两个亚基组成的，用超速离心方法测其沉降系数，分别为30S和50S。当我们还不知道它们的结构时，也只好暂时以30S和50S命名，来区别它们。蛋白质的沉降系数，一般在1200之间。表1-1 计算离心力的列线图为了从半径和转头速度来计算相对离心力，先以外侧标尺上的半径和转头速度的值连成直线。这
8、一直线与中间标尺上的交点数值，就是相对离心力。我们知道，沉降系数，是一个特定的物理量。因此，S020,w是一个常数（constant）。从沉降系数的定义可以看出，它只在标准化条件下才是一个常数。但实际情况往往变化很大。因此在实际应用中，常把标准条件下的沉降系数（S020,w）换算成实际条件下沉降系数，才能正确运用。因为实际测量时，所用的条件大不相同，所以常常将在某种条件下测定的沉降系数加以修正。利用这个公式进行运算以后，可以把任何条件下所测定的S值，变成以20C的水的密度和粘度为介质时，得到的S值。S020,w 为以水为介质时，20C所测得的沉降系数。St,m 为在t温度下，以m为介质时，所得
9、的沉降系数。h20,w 为20C水的粘度。ht,m 为介质在离心温度下的粘度。rp 为颗粒的密度。rt,m 为介质的密度。r20,w 为20C水的密度。沉降系数可用下更公式求得：式中w 是角速度。t为时间（秒），变化着的时间用时间的微分dt表示。r是颗粒运动的距离，指运动颗粒到离心转轴中心的距离（厘米）。设单位时间内某颗粒自r1运动到r2，则上式得积分得若用rpm计算，则w =（rpm） 2p/60，再将自然对数改为常用对数，则上式可写为：式中2.303/60w2与rpm的换算可从表2-1中查出，式中的d log r/ dt可用log r 对t 作图求得。表2-1 w2与2.303/60w2
10、换算关系转速（rpm）w22.303/60w2转速（rpm）w22.303/60w216974.2411049.05010-7125901.7381062.20810-820974.8111047.97810-7134101.9711061.94710-822335.4661047.02210-7142902.2381061.70510-823786.1191046.19210-7152202.5391061.51210-825317.0221045.46610-7162002.8771061.33410-856957.9621044.82110-7172503.2621061.17710-8
11、28068.6491044.43810-7179803.5441061.08310-829949.8261043.90610-7191604.0241069.53910-931891.1151053.44210-7204104.5661068.40610-933971.2651053.03410-7217405.1811067.40810-936171.4341052.67710-7231505.8751066.53310-938481.6231052.36510-7246406.6501065.77210-940591.8061052.12510-7259807.3991065.18810-
12、943272.0521051.87110-7276908.4051064.56710-946092.3291051.64810-7295009.5401064.02310-949082.6411051.45310-7314101.0821073.54710-952272.9951051.28210-7334501.2271073.12810-955633.3921051.13210-7356001.3891072.76310-957843.6621051.04810-7370201.5021072.55510-961664.1681059.20910-8394601.7071072.24910
13、-965694.7301058.11510-8420401.9371071.98210-969955.3641057.15610-8447702.1971071.74710-974473.0791056.31410-8476602.4901071.54110-979286.8901055.57110-8507402.8221071.36010-982257.4161055.17610-8526403.0381071.26310-987668.4241054.55610-8561003.4501071.11310-993419.5651054.01310-8597803.9181079.79710-1099451.0841053.54110-8636504.4401078.64310-10105891.2291063.12310-8677705.0351077.62310-10112721.3931062.75510-8721405.7051076.72810-10表2-2 某些生物样品的沉降系数、相对离心力和转速的一般范围样品沉降系数（S）RCF（g）转速（rpm）细胞10720040万60000有了沉降系数，可以计算分
