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1、 . . . . 影响PCR反应的条件(1) 引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。设计引物应遵循以下原则:引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基:G+C 含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5 个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。引物3端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱
2、基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量: 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol,以最低引物 量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。(2)酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引
3、起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。(3)dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris.HCL的缓冲液将其 PH调节到7.07.5,小量分装, -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。(
4、4)模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本。SDS的主要功能是: 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与蛋白质结合而沉淀; 蛋白酶K 能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K
5、法,要防止RNase降解RNA。(5)Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。(6)温度与时间的设置: 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在9095变性,再迅速冷却至40 60,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至7075,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为1
6、00300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94变性,65左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,9394lmin足以使模板DNA变性,若低于93则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模
7、板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20 个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec,足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性:7080 150 核苷酸/S/酶分子70 60 核苷酸/S/酶分子55 24 核苷酸/S/酶
8、分子高于90时, DNA 合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间,常用温度为72,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够 的。34kb的靶序列需34min;扩增10Kb 需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。(7)循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。 影响pcr特异性的因素通过上述内容,可以看出有
9、许多因素可以影响pcr的特异性,在此我们作一归纳,供大家参考:退火步骤的严格性:提高退火温度可以减少不匹配的杂交,从而提高特异性。减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。引物二聚体是最常见的副产品,降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发,尤其是引物的二聚化。改变mgcl2(有时kcl)浓度可以改进特异性,这可能是提高反应严格性或者对taq酶的直接作用。一般认为PCR产物应在48h以内完成电泳检测,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型就会出现不规则,甚至消失。 Trouble shooting guide1假阴性,不出现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的制备,引物的质量与特异性
10、,酶的质量, PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板:模板中含有杂蛋白质,模板中含有Taq酶抑制剂,模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因为酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时PCR时忘了加Taq酶或电泳时忘了加溴化乙锭。引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理
11、想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。引物使用过程中应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓
12、度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20l、30l、50l或100l,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20l后,再做大体积时,一定要重新摸索条件,否则容易失败。物理原因:温度对PCR扩增来说相当重要。如果变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率;退火温度过高,影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下PCR仪或水浴锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失
13、败的原因之一。靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。 2假阳性引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外。除了酶及其他不耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头均应一次性使用。
14、必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。3出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次,是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:必要时,重新设计引物。减低酶的量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性,65左右退火与延伸,也叫两步法)。4出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶的量过大或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:减少酶的量,或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量,减少循环次数 . 专业word可编辑 .