冰冻切片实验步骤

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1、全部实验步骤1 取新鲜组织于 4%多聚甲醛固定 24 小时2 30%蔗糖脱水 48 小时以上3 -250C 包埋（冰冻切片机内）4 冰冻切片冰冻切片步骤冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片 48m，室温放置 30 分钟后，入 4丙酮固定 10 分钟，PBS 洗，5 分钟3 次。用 3%过氧化氢孵育 510 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS 冲洗， 5 分钟2 次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子)你确定你是冰冻切片吗？冰冻切片不能用热修复啊！以下是我的步骤：1 冰冻切片室温放置 30 分钟后，入 4丙酮固定 10 分钟，PBS 洗，5 分钟3。用 3过氧化氢孵育5

2、10 分钟， PBS 洗，5 分钟2。2 510正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37 孵育 12 小时或 4过夜。3 PBS 冲洗， 5 分钟3 次。4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37或室温孵育 30 分钟。PBS 冲洗，5 分钟3 次。5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37或室温孵育 1030 分钟。6 PBS 冲洗， 5 分钟3 次。7 显色剂显色（ DAB） 。8 自来水充分冲洗，复染，封片。冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用 3%H2O2/甲醇溶液，室温 20 分钟。此配方不易产

3、生脱片。配制方法是在 9ml 甲醇中加 30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片 48mm，室温放置 30 分钟后，入 4丙酮固定 10 分钟，PBS 洗，5 分钟3。用 3过氧化氢孵育 510 分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS 洗，5 分钟 2。 下接免疫组化染色操作步骤。免疫组化染色步骤：（SP 试剂盒为例)1 冰冻切片 48um，室温放置 30 分钟后，入 4丙酮固定 10 分钟，PBS 洗，5 分钟3。用 3过氧化氢孵育 510 分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS 洗，5 分钟 2。2 510正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室

4、温孵育 10 分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37 孵育 12 小时或 4过夜。3 PBS 冲洗， 5 分钟3 次。4 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS 稀释） ，37孵育 1030 分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37 或室温孵育 1030 分钟。PBS 冲洗，5 分钟3 次。5 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS 稀释） ，37孵育 1030 分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 或室温孵育 1030 分钟。6 PBS 冲洗， 5 分钟3 次。7 显色剂显色（ DAB 或 AEC） 。8 自来水充分冲洗，复染，封片

5、。1. 冰冻切片 4um 左右，室温 25C 复温 30min，浸入 4C 预冷的丙酮固定 10min，2. PBS（PH 为 7.2-7.4）在 9cm 皿内摇床冲洗 3 次，每次 5min（第一次冲洗时间短些，约1min 后更换）3. 用 3%过氧化氢一份，纯甲醇 50 份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。4. PBS（PH 为 7.2-7.4，酸性）在 9cm 皿内摇床冲洗 3 次，每次 5min（第一次冲洗时间短些，约 1min 后更换） ，甩去 PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持 5mm 左

6、右距离，太近会导致边缘效应。5. 5%BSA，室温孵育 20min，期间注意观察，以免 BSA 干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。6. 甩去血清，PBS 洗 1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。7. 配置一抗工作液用 5%BSA（抗体浓度为 1:100） ，悬空加入一抗工作液 50-100ul，枪头不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。8. 放入湿盒内，置于 4C 冰箱过夜（最长不可超过 48h） ，注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织

7、干掉，出现背景高和假阳性） ，孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用 PBS 清洗浸泡。9. 第二天上午取出玻片，置常温复温 30min，后 PBS 冲洗 1+5+5+5min，10.滴加 1:100 生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在 EP 管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育 30min-1h，后 PBS 冲洗 1+5+5+5min。11.滴加 1:100 比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素 PBS 稀释液（SABC）室温1h，后 PBS 冲洗 1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。12.DAB 显色，显色时放置在白色纸上，观察显色程度以终止 DAB 反应，最好

8、把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加 DAB，观察到阳性区和阴性区差异后终止，此时最好有计时，以便于今后重复试验控制显色时间（一般显色时间 2s-10min，显色时间过长背景高，且可靠性低）13.终止 DAB 显色可将玻片置于染色缸内，用自来水流水稀释终止 5min，后在显微镜下观察是否有 DAB 颗粒附着。14.甩干水分，苏木素复染（如为加汞的苏木素，显色时间为 6-10s，可不用酒精分化，直接用 PBS 返蓝，如为非加汞苏木素，需在盐酸酒精分化） ，苏木素终止亦可用自来水冲洗终止反应。15.水洗后梯度酒精脱水二甲苯透明（75%-85%-95%-100%-100%-二甲苯 1-二甲苯

9、 2）个3min，滴加中性树胶封片，中性树胶浓度以不拉丝为宜16.封片后干燥 1h(或者在通风橱吹风的情况下 15min)，用棉球沾湿二甲苯擦去溢出的树胶。观察照相。针对脱片问题，我做了如下处理。但仍存在脱片现象，麻烦您给我提一些相关的建议。自来水冲洗玻片，晾干后，多聚赖氨酸的涂胶以下两种方法我都试过1. 单涂胶：往一张玻片上加0.01%的多聚赖氨酸80ul，用另一张玻片推片，然后叠加其上，停留5分钟，中间推动玻片数次，使液体涂抹均匀，分开两张玻片，滤纸吸干玻片下缘，置玻片架上60 0C烤干1h备用。2. 双涂胶：往一张玻片上加0.01%多聚赖氨酸80ul, 单涂胶60 0C烤干,同样方法重复

10、涂胶1次 600C烤干,备用。我用过的尼氏染色的方法，效果不错。1 溶液配制：(1) 溶液 A：焦油固紫 0.2g, 纯水 500ml(2) 溶液 B：0.1M 冰醋酸 冰醋酸 3ml， 纯水 500ml(3) 溶液 C：0.1M 无水醋酸钠 无水醋酸钠 4.1g，纯水 500ml(4) 溶液 D：PH3.54.5 醋酸缓冲液 B 液 94mlC 液 6ml(5) 工作液：A 液 10mlD 液 90ml 过滤后使用，避光保存注：焦油固紫遇光分解，整个过程应避光操作，可以用黑色塑料袋罩着。2 具体步骤： 如果为石蜡切片，先进行脱蜡处理，然后从步骤开始；如果为冰冻切片，从步骤开始。 将凉干的切片

11、放入纯水中 35min 。 切片放入焦油固紫染色液中 11.5h。 切片放入纯水中洗去浮色。 切片放入 70 8095的酒精分色，各几秒钟，时间自己掌握，以不见掉色为好。 切片放入特殊分色液中褪背底（1：1 ：1 的无水乙醇，氯仿，乙醚） 。 切片放入 100乙醇，5min3 次；二甲苯 5min3 次，透明封固。整个过程要保证切片不能干掉。3、结果尼氏小体：深蓝紫色；核、核仁：浅紫色；背底：洁白无色。我个人觉得特殊分色液挺重要的Highman 甲醇刚果红染色法（类淀粉染色）1、试剂配制：甲醇刚果红染液: 刚果红 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml碱性乙醇分化液: 氢氧化钾 0.2

12、 g 80%乙醇 100 ml2、染色步骤 :（1）切片脱蜡至水（2）甲醇刚果红染液染 1020 分钟（3）用碱性乙醇分化液分化数秒（4）水洗（5）苏木素复染 2 分钟（6）水洗（7）脱水 ,透明,封固3、结果：淀粉样物呈桔红色。 4、类淀粉染色的应用：确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织，后者在刚果红法染色后呈淡桔色， 冰冻切片脱脂问题：0.5 盐酸乙醇分化液 配置直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活

13、检、皮肤活检的免疫病理检查。试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制 搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml） 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） 荧光显微镜 玻片架 滤纸 37温箱等。实验步骤1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 于待检标本片上，10min 后弃去，使标本保持一定湿度。2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置

14、于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min） 。3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，pH7.4 的PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（ ）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（+）荧光明亮；（+ -+）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“+” 以上，而各种对照显示为（）或（- ） ，即可判定为阳性。注意事项1. 对

15、荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过 1：20 ，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数小时，一般30 min 已足够。染色温度多采用室温（25左右） ，高于 37可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用 0-2的低温，延长染色时间。低温染色过夜较 3730 min 效果好的多。3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。（1） 标本自发荧光对照：标本加 1-2 滴 0.01mol/L，

16、pH7.4 的 PBS。（2） 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。（3） 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。4. 一般标本在高压汞灯下照射超过 3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。免疫荧光的标本制作的基本程序同 DAB 显色的免疫组化：不同的是1 免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同2 免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定3 二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS （1：1 ）5 条件许可可