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1、第15章 分子发光分析法分子发光分析法 Molecular Luminescence AnalysisMolecular Luminescence Analysis 第15章 分子发光分析法 Molecular Luminescence Analysis 分子吸收能量 电子由基态进入激发态 当电子由激发态 返回基态时发射光谱 M 能量 M M 热量 M h 热量 光子 光致发光 M h M 阴极射线 阴极射线发光 荧光 磷光 X 射线 X 射线发光 F P 热 白炽发光 寿命10 7 10 9s 10 3 10s 超声波 声纳发光 离子流 离子发光 化学反应能 化学发光 M 化学能 M 第一次
2、记录荧光现象 1575 西班牙内科医生 植物 学家 荧光是光发射概念 引入荧光术语 1852 Stokes 观察奎宁 叶绿素 提出用荧光作为分折手段 1864 Stokes 第一个实际应用 铝一桑色素荧光测 1867 1965以来 荧光光谱兴趣激增 生物化学 家利用它的高灵敏度 二十世纪七十年代后 期 引起国内学者注意 第15章 分子发光分析法 Molecular Luminescence Analysis 第15章 分子发光分析法 Molecular Luminescence Analysis 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 15 2 荧光分析法 15 3 磷光分析法 15 4 化学发
3、光分析法 15 5 光化学传感器 荧光 涉及吸收和发射两个过程 1 激发态 基态 激发态 分立轨道上 非成对电子 平行自旋更 n 稳定 n 净电子自旋 S 0 S 0 S 1 分子重态 M 2S 1 1 跃迁几率很小 M 2S 1 3 单重基态 S0 激发单重态 S 激发三重态 T 电子从 S0 到 S 分子能量相应增加改变了分子对称性 分子净的电子自旋 多重性 可能改变 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 2 去活化过程 溶液中 10 14 10 12 s 10 13 10 11 s 10 2 10 6 s 振动弛豫 内部转换 体系间的跨越 发生在相同多重度间 发
4、生在不同多重度间 S2 S1 T1 S1 T2 10 15 s A1 A2 F P 磷光发射 10 2 10 s 基态 S0 荧光发射 外部转换 10 7 10 9 s 发生在不同电子能态间 熄灭 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 2 去活化过程 注意点 1 气相分子中易观察到以发射光子方式失去振动能 2 实现内部转换 a S1 S2 电子能级差小 易实现 b S1 S2 振动能级的位能面有交叉 3 体系间跨越的必要条件 电子自旋与磁场微扰耦合 a S1 T1位能面在某处有容易达到的能量相交 激发态电子自旋反转 b 微观磁场的微扰存在 分子多重态变化 产生 Br
5、I CH3I 重原子分子 带电粒子的极性分子或可极化分子易产生磁效应 或离子外层电子云疏松 顺磁性分子 O2 外层3d5五个电子不成对 内 4 外部转换使发光熄灭现象 重原子效应 T1 S0 比 S1 S0 可能性更大 外 溶剂 5 去活化众多过程中 以速度最快 激发寿命最短的途径占优势 相互竞争 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 荧光的一些基本问题 a 荧光类型 1 从寿命 瞬时荧光 10 8s 内发射 分析中有意义 S1 S0 h S1 S0 S1 S0 2S0 h 受激准分子 迟滞荧光 波长同瞬
6、时荧光 寿命与磷光相似 刚性 粘稠介质中 E型 T1 活化能 S1 S0 h P 型 T1 T1 S1 S0 三重态 三重态粒子湮没 S0 h 寿命为相随磷光寿命的 1 2 复合 重组 A h 1 A h 2 A e 重组 e A h 3 A 荧光的一些基本问题 a 荧光类型 2 激发光与荧光波长比较 Stokes荧光 溶液中 荧 激 可能 Antistokes荧光 高温稀薄气体中 荧 激 共振荧光 气体 晶体中 荧 激 3 荧光波长 X光荧光 紫外 可见荧光 红外荧光 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 荧光的一些基本问题 b 分子被激发时的散射问题 激发光的能量
7、太低 不足以外层电子跃迁到 S1 但仍可将电子激发至基态的高振动能级上 受激后能量无损失 受激发后有能量改 瞬间 10 12 返回原 变 返回原来稍高 能级 或稍低能级上 在不同方向上发射与原激 不同方向伴随的波长 发光相同波长 1的辐射 发射为 1 瑞利散射 拉曼散射 特征 散射强度 1 4 拉 强度 瑞 强度 IF 1000 散射光波长 激发光波长 拉曼带波长随激发光波长而变 拉 F 为定值 反映了分子结构特性 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 荧光的一些基本问题 c 激发光谱和荧光光谱 1 激发光谱 2 荧光光谱 注意 实际测得的荧光光谱和激发光谱随仪器而异
8、 其真实光 谱必须要对其光源 单色器 检测器的光谱特性加以校正 真实的激发光谱与吸收光谱非常近似 而不是相同 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 荧光的一些基本问题 c 激发光谱和荧光光谱 3 溶液荧光光谱的特征 斯托克斯位移 荧 激 原因 溶剂化效应 h h 非辐射损失 荧光光谱与激发光波长无关系 原因 荧光光谱与激发光谱成镜像对称关系 光谱形状决定于S1 S2的振动能级分布相似 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 荧光的一些基本问题 c 激发光谱和荧光光谱 4 三维荧光光谱 总发光光谱 激发 发射矩阵 等 高线光谱 给出三维信息 第1
9、5章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 荧光的一些基本问题 d 荧光物质的两个重要参数 1 荧光分子的平均寿命 各种单分子的非辐射去 1 kf K 活化过速率常数之总和 荧光发射速率常数 内在寿命 0 即 K 时的 0 1 kf 荧光强度衰变 速率方程 It I0 e t 或 It I0 t 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 荧光的一些基本问题 d 荧光物质的两个重要参数 2 荧光的量子产率 f 定义 发射荧光的光子数 吸收辐射的光子数 f kf kf K f 0 1 1 有使用价值 注意 a 荧光的能量产率 eq 荧光发射时的能量 吸收的能量
10、 eq 1 红移 b 荧光的量子效率 f 处于发射荧光的激发电子态的分子的百 分率 c f eq f三个概念不同 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 4 荧光 磷光的测量 一般荧光分光光度计与紫外可见区吸光光度计异同 单束 光用于校正 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 4 荧光 磷光的测量 荧光分光光度计 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 4 荧光 磷光的测量 a 激光荧光光度计 1975 Harrington 研制 输出 反射 染料池 样品池 光栅 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发
11、射因素 4 荧光 磷光的测量 b 电视荧光计 使用多色仪 Johnson设计 入射口狭缝 样品池长轴 波长复盖 240nm 氙灯 无出射口狭缝 空间分辨 1 nm 入射口狭缝 样品池长轴 时间分辨14 7 ms 无出射口狭缝 摄像管 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 4 荧光 磷光的测量 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 5 影响荧光发射因素 a 强荧光物质的结构特点 比 n 有利 f 共轭 体系 f 刚性平面结构 f 取代基影响 给电子基团 f 吸电子基团 f p 取代基位置 邻 对 f 重原子取代基 f p 第15章 分子发光分析
12、法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 5 影响荧光发射因素 b 溶液环境因素 溶剂 取决于荧光体和溶剂的化学结构 溶剂 荧光物成化合物 荧光分子电离状态改变 f max f 都有影响 重原子溶剂存在时 f p 外重原子效应 温度 T f pH 平衡解离关系存在 f max f 均有影响 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 6 溶液荧光的猝灭 定义 荧光分子与其它分子相互作用 改使 荧光强度下降 猝灭过程实质题与发光过程相互竞争 缩 短发光分子激发态寿命的过程 具体形式机理 各不相同 自学讲义内容 第15章 分子发光分析法 15 1 光致发光及影响荧光发射因素 1
13、 常规方法 a 直接法 b 间接法 与荧光试剂发生反应 定量关系 If 2 3 f I0 b c b c 0 05 时 If k c I0 b 不变 定量校正方法 外标法 增量法 2 荧光猝灭法 F 会使8 羟基喹啉 铝配合物 荧光强度 测F 第15章 分子发光分析法 15 2 荧光分析法 3 动力学荧光分析法 反应物或产物中的荧光物质浓度变化 测荧光随时间变化求含量 方法 Fe H A Fe B dB dt A Fe H 当pH 一定 A 足够大 反应初期 积分 B Fe t 又 I f B K B 则 I f B Fe t 或 I f B t Fe Y a x 第15章 分子发光分析法 1
14、5 2 荧光分析法 荧光滴定法 鲁米诺指示剂 H 时 UV下 兰荧光 OH 时 UV下 无荧光 胶束增敏荧光分析 荧光试剂 配合反应 优点 a 光学透明 稳定 b 光化学上是非活性的 c 价廉 使用方便 d 对荧光测量有增溶 增敏 增稳的独特性质 第15章 分子发光分析法 15 2 荧光分析法 A B混合物在测量条件下 荧光光谱相互重叠 时 如何测量A B 两物质 信息处理及仪器技术 6 双波长法 三波长法 7 导数荧光法 8 同步荧光光谱技术 同时利用吸收和发射两个过程 固定波长固定波长 例 丁省乙醇溶液 荧 激 常数 如何决定 Stoks 位移值 第15章 分子发光分析法 15 2 荧光分
15、析法 简化光谱 窄化谱峰 8 同步荧光光谱技术 固定能量 1 激 1 荧 107 常数 例 芳环 1400 cm 1 振动带间隔 可变角 两者起始波长不同 扫描速率不同 保持同一比例 线性 测c 某一函数 非线性 干扰A 免避散光 提高重叠体系分辨率 激发波长 干扰B 发射波长 第15章 分子发光分析法 15 2 荧光分析法 9 时间分辨荧光技术 利用 寿命信息 排除干扰 应用 a 荧光探针技术 b 单分子测量技术 第15章 分子发光分析法 15 2 荧光分析法 1 磷光与荧光的不同点表现在 a 峰值波长 P F b p F c p I p 受重原子 顺磁性分子 离子存在增强 敏感 F IF
16、反之 2 磷光测量方法 a 与荧光测量类同 不同点 固体样发射磷光 伴随发射荧光 b 如何解决 磷光同光源散射 磷光同 荧光 分离开来 如旋转简磷光计 第15章 分子发光分析法 15 3 磷光分析法 2 磷光测量方法 第15章 分子发光分析法 15 2 磷光分析法 3 常规 低温 磷光法 a 为什么要低温测量 减少非辐射跃迁对磷光发射影响 b 如何实现低温测量 液氮77 K EPA 明净玻璃态 c 定量关系式 醚 5 异戌烷 5 乙醇 2 Ip 2 3 pI0 b c Kpc 磷光的量子产率 p KST KP KST KF Ki KP Kj 与S1态有关的非辐射跃速率 除KST外 与T1态有关的非辐射跃迁速率 d 重原子效应的利用 灵敏度 选择性 第15章 分子发光分析法 15 2 磷光分析法 4 室温磷光法 a 为什么要引入室温磷光法 常温法缺点 低温装置复杂 溶剂选择 操作难 b 室温法要解决主要矛盾 克服室温下 T S0 的非辐射跃迁 使IP 途径 固体表面室温磷光 胶束稳定的溶液室温磷光 1972年 1980年 固体载体 第15章 分子发光分析法 15 2 磷光分析法 5 敏化
