酶工程动植物细胞培养产酶

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1、酶酶 工工 程程 Enzyme EngineeringEnzyme Engineering 第第 三三 课课 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 The production of Enzyme byThe production of Enzyme by Culturing of Animal or Plant CellsCulturing of Animal or Plant Cells Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 概述 动物细胞 无细胞壁 容易贴壁 对营养要求严格 血清培养基 对环境敏感 pH 溶氧 温度 剪

2、切应力 植物细胞 有细胞壁 但比微生物的细胞壁脆弱 营养要求较动物细胞简单 生长缓慢 培养周期长 要达到高密度较困难 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 概述 植物细胞与动物细胞 微生物细胞培养的比较 特征哺乳动物细胞植物细胞微生物细胞 大小 m 10 10010 1001 10 生长形式悬浮 贴壁悬浮悬浮 营养要求很复杂很复杂简单 倍增时间 h 15 10020 1200 5 5 细胞分化有有限分化无 环境影响非常敏感敏感一般 产物存在部位胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外 产物浓度低低高 供氧需求 KLa 1 2520 30100 100

3、0 产物种类 疫苗 单抗 酶 生长因子 激素等 天然色素 天然 有机化合物等 抗生素 有机 小分子 酶等 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 概述 植物细胞与动物细胞 微生物细胞培养的比较 动物细胞 植物细胞和微生物细胞可以用相同方式培养 动物细胞 植物细胞的生产周期比微生物长 植物细胞和动物细胞对剪切力敏感 植物 微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同 动物细胞 蛋白疫苗 抗体 激素 酶 蛋白质或多肽 植物细胞 色素 香精 天然产物 小分子 酶 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶

4、本章主要内容 动植物细胞中酶生物合成的调节 植物细胞培养产酶 植物细胞及其培养特点 植物细胞培养及产酶的工艺控制 动物细胞培养产酶 动物细胞及其培养特点 动物细胞培养及产酶的工艺控制 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 动植物细胞中酶生物合成的调节 从基因到蛋白质 有关微生物细胞中酶合成的调节理论也基本适用于动植 物细胞 动植物细胞具有比微生物更多的调节方式 转录水平调节 翻译水平调节 激素 神经调节 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 动植物细胞中酶生物合成的调节 细胞分化改变酶的

5、生物合成 端粒 telomere 端粒是真核生物染色体的末端结构 由富含 G T 的 DNA 简单重复序列不断重复而成 人端粒序列 TTAGGG 保护真核生物染色体免遭破坏 牺牲自我 填补 DNA 复制后在5 端留下的空隙 端粒随细胞年龄的增长而逐渐缩短 端粒酶 telomerase 催化端粒合成和延长 核糖核蛋白 其中的 RNA 部分含核苷酸模板序列 可构建端粒重 复序列 端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 动植物细胞中酶生物合成的调节 基因扩增加速酶的合成 通过增加基因的数量调节基因表达 可以发生

6、在个体发育某一阶 段或细胞分化某一过程 细胞的一种应急方式 基因扩增可以由选择压力引起 耐药性细胞的抗药性产生 例 CHO 细胞为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶的抑制 编码 这种酶的基因急剧扩增 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 动植物细胞中酶生物合成的调节 增强子促进酶的生物合成 增强子 modulator 能高效增强或促进基因转录的一段 DNA 序列 增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性 可高效增强某些 酶基因的表达 具有细胞或组织特异性 在不同细胞或组织中增强效果不同 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细

7、细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 动植物细胞中酶生物合成的调节 抗原诱导抗体酶的生物合成 抗体酶 abzyme 催化性抗体 是 具有生物催化功能的抗体分子 是人 工改造的对抗体可变区赋予催化特性 的特殊抗体 修饰法 在抗体与抗原结合部位引进催化基团 诱导法 主要方法 半抗原诱导 酶蛋白诱导 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 1902年 Haberlandt首次提出分离植物单细胞并培养成 植株的设想 植物细胞的全能性 HaberlandtHaberlandt Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细

8、胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 植物细胞培养产酶种类 产酶植物细胞产酶品种 胡萝卜细胞糖苷酶 紫苜蓿细胞 半乳糖苷酶 甜菜细胞过氧化物酶 酸性 碱性转化酶 糖化酶 大豆细胞过氧化物酶 苯丙氨酸裂合酶 花生细胞苯丙氨酸裂合酶 假挪威槭细胞漆酶 利马豆细胞 葡萄糖苷酶 番木瓜细胞木瓜蛋白酶 木瓜凝乳蛋白酶 大蒜细胞超氧化物歧化酶 菠萝细胞菠萝蛋白酶 剑麻细胞剑麻蛋白酶 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 植物细胞结构 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶

9、植物细胞培养产酶 植物细胞的主要特点 体积较大 比动物细胞和微生物细胞都大 细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞 生长周期长 营养要求较动物细胞简单 细胞生长及合成次级代谢产物需要光照条件 对剪切力较敏感 主要用于产天然产物 色素 香精等有机物 次级代谢物 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 植物细胞培养的优势 提高目标物的产率 缩短生产周期 木瓜蛋白酶 木瓜生长期8个月 木瓜细胞培养约1个月 易于管理 不受自然因素控制 可以提高产物质量 通过严格的培养条件控制 减少植株病虫害和污染 缺点 培养条件要求高 光照 剪切力影

10、响显著 植物细胞生长缓慢 相对于微生物 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 植物体外培养 胚培养 器官培养 愈伤组织培养 细胞培养 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 植物细胞培养 外植体选择和处理 外植体 explant 从植株取出 经预处理后用于组织和细胞培养的植物组织片段或小 块 根 茎 叶 芽 花 果实 种子等 选择 无病虫害 生长旺盛 生长有规则 切片 0 5 1 cm 消毒 70 乙醇 5 次氯酸钠 10 漂白粉 0 01 0 1 Hg

11、Cl2 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 植物细胞培养 获取植物细胞 直接分离法 直接分离法即直接从外植体中分离 机械法 将外植体捣碎 过滤或离心分离细胞 质壁未分离 细胞破碎率高 完整细胞数量少 酶解法 利用果胶酶 纤维素酶等处理外植体 分离具有代谢活性的细胞 能降解细胞壁 必须对细胞给予渗透压保护 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 植物细胞培养 获取植物细胞 愈伤组织诱导法 愈伤组织 callus 由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的疏

12、散排列的薄壁细胞 群体 本意是指植物体的局部受到创伤刺激后 在伤口表面新生的 可帮助伤口愈合的组织 诱导过程 配制半固体诱导培养基 灭菌 植入外植体 1 3周后继代培养 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 植物细胞培养 获取植物细胞 原生质体再生法 一般采用酶解法分离原生质体 使用纤维素酶和果胶酶混合物 保持溶液的高渗状态 防止原生质体胀裂 渗透压稳定剂 糖 盐 甘露醇 山梨醇等 原生质体培养 再生细胞壁 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 植物细

13、胞培养 悬浮培养 将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基 中进行培养的方法 悬浮培养的细胞一般来源于愈伤组织 选择较松散的为宜 植物细胞培养 产物分离纯化 收集培养液 从中获得所需的产物 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 植物细胞培养基 水 一般用去离子水或蒸馏水 无机成分 大量元素 N P K Ca Mg S 微量元素 Fe B Mn Zn Cu Mo Co 有机成分 碳源 糖 以蔗糖最常用 氮源 氨基酸 Gly Ala Ser Cys 及蛋白水解物 无机氮 维生素 主要是B族维生素和维生素C 生长

14、调节剂 生长激素 细胞分裂素等 微量 其他 肌醇 琼脂等 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 常用的植物细胞培养基 MS 培养基 硝酸盐浓度较高 营养成分适宜 使用范围广 B5 培养基 NH4 浓度较低 适用于双子叶木本植物 White 培养基 无机盐浓度低 高Mg II B III 适用于生根培养 KM 8P 培养基 有机成分种类齐全 用于原生质体培养 培养基配制 配制母液 使用时按需要稀释 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 工艺条件及其控制

15、温度 室温范围 25 oC左右 最适产酶温度和最适生长温度不同 pH 微酸性 pH 5 6 细胞培养时 pH一般变化不大 溶解氧 植物细胞需氧量不高 供氧不宜过量 对剪切力敏感 通风搅拌不宜太剧烈 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 工艺条件及其控制 光照 光照对植物细胞的生长和产物合成具有重要影响 植物特色 光照有时也抑制产物合成 添加前体 前体 处于目的代谢物代谢途径上游的物质 添加前体相对于添加了反应的底物 刺激剂 elector 引导物质朝特定的代谢方向进行 强化次级代谢产物的生物合成 常用微生物细胞壁碎片和胞外

16、酶 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 产酶实例 大蒜细胞培养产 SOD 超氧化物歧化酶 superoxide dismutase SOD EC 1 15 1 1 生物体内清除超氧化物阴离子自由基 O2 的重要金属酶类 SOD 和过氧化氢酶 catalase 过氧化物酶 peroxidase POD 一 起构成了生物体内重要的酶促反应防御体系 从而维护生物体内细 胞正常的生理代谢和生化反应 Enzyme Engineering 动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶 植物细胞培养产酶 产酶实例 大蒜细胞培养产 SOD 大蒜愈伤组织的诱导 选取结实 饱满 无病虫害的大蒜蒜瓣 去除外皮 先用70 乙醇消毒 20 s 再用0 1 升汞消毒 10 min 然后无菌水 漂洗3次 在无菌条件下 切成0 5 cm3 的小块 植入含有3 mg L 2 4 D和1 2 mg L 6 BA 的半固体 MS 培养基中 25 oC 600 lux 12 h d光照条件下培养18天 诱导得到愈伤组织 每18天继代一次 Enz