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1、概论+抗原抗体反应1 免疫学基本概念及其生物学功能；免疫：机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能免疫三大功能：免疫防御、免疫自稳、免疫监视中枢免疫器官（骨髓和胸腺）外周免疫器官（淋巴结、脾脏、扁桃体）免疫细胞：淋巴细胞（T，B，NK） 、单核巨噬细胞、其他免疫应答细胞（中性粒、嗜酸性、嗜碱性和肥大细胞）免疫分子：免疫球蛋白（IgM，IgG，IgA，IgE，IgD） ，补体，细胞因子，细胞黏附分子，人类白细胞分化抗原免疫应答：机体免疫系统接受抗原刺激发生的一系列反应，并以排出或分解该抗原为目的的反应过程。过程：抗原的识别、处理、信息传递（识别阶段） ，免疫细胞的激活、增殖、分化（活化阶段）以及产
2、生一系列的免疫效应因子（效应阶段） 。临床免疫学检验：研究免疫学检测理论、技术、应用，免疫疾病发病机制、免疫诊断、及防治的一门医学领域的应用学科。免疫学检测技术的基础是抗原抗体反应，免疫学技术有凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应、中和反应和标记免疫反应五种类型。免疫检验：1）利用免疫检测原理和技术检测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细胞因子、细胞黏附分子等免疫相关物质；2）体液中的微量物质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓度、微量元素。临床免疫学：利用免疫学理论和技术研究疾病的免疫病理机制、诊断和鉴别诊断、疗效评价、预后判断和预防的多个分支学科的总称。免疫性疾病：各种原因引起的机体免疫应答异
3、常所致的疾病，包括超敏反应性疾病、自身免疫病、免疫缺陷病和免疫增生病。感染免疫学：研究病原微生物与宿主相互关系从而控制感染的学科，传统免疫学核心。肿瘤免疫学：研究肿瘤免疫原性、机体抗肿瘤的免疫效应及机体的免疫功能与肿瘤发生、发展的相互关系以及肿瘤免疫诊断与防治的学科。移植免疫学：研究移植物与宿主相互关系从而选择移植物和延长移植物存活的学科。2 血清学反应的概念；抗体主要存在于血清中，体外的抗原抗体反应称为血清学反应。抗原抗体反应：抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应，特异性取决于抗原表位和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性，并通过静电引力、范德华引力、氢键结合力和疏水作用力等非共价
4、键结合在一起。3 抗原抗体的反应原理Ag 决定簇和 Ab 分子超变区分子间的结构互补性；分子表面特异的可逆的弱结合力；亲水胶体转化为疏水胶体* 亲和力（affinity） 是抗体分子上一个抗原结合点与对应抗原表位之间相互适应而存在的引力。这是抗原与抗体之间固有的结合力。* 亲合力（avidity) 是指反应系统中整个抗原分子与相应抗体之间的结合能力。亲和力与亲和性、抗体的结合价和抗原的抗原决定簇数目相关。亲和力越大，抗原抗体结合越牢固。K=抗原抗体复合物浓度/（游离抗原浓度*游离抗体浓度）K 值大的抗体与抗原牢固结合，不易解离，说明该抗体有高亲和力。亲水胶体转化为疏水胶体：血清学反应条件下，抗
5、原抗体均带负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体。 当抗原与抗体结合后，表面电荷减少，水化层变薄，失去亲水性能，抗原抗体复合物成为疏水胶体。 电解质作用下，中和胶体表面电荷，使疏水胶体靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。4 抗原抗体反应的特点。特异性：抗原与抗体结合反应的专一性。分子基础:抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性交叉反应：两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结构的抗原表位，可与彼此相应的抗血清发生反应可逆性： 解离后抗原抗体仍保持原有理化性质和生物活性。影响因素：抗体与抗原间的亲合力，亲合力越高，结合越牢固，越不易解离；环境因素pH、离子强度 比例性：抗原与抗体
6、发生可见反应需遵循一定的量比关系。前带(prezone)：抗体过量。后带(postzone)：抗原过量。等价带(equivalence zone)：抗原抗体比例合适 阶段性：亲水胶体转疏水胶体的化学和物理变化过程：抗原抗体特异性结合（几秒至几分钟，不出现可见反应） ，非特异性促凝集（抗原-抗体复合物在适合温度 pH 电解质等环境因素影响下，进一步交联和聚集，出现肉眼可见沉淀、凝集、细胞溶解等反应，数分钟至数小时）【熟悉免疫学发展简史；抗原及免疫球蛋白的定义及功能5 抗原抗体的反应影响因素。反应物自身因素： *抗原：1.理化特性 2.Ag 决定簇数量 3.Ag 决定簇种类 *抗体：1.来源 2.
7、特异性与亲和力 3.浓度环境条件：*电解质：0.85%NaCl*使 Ag-Ab 表面的电势下降，失去电荷，破坏水化层，形成凝集或沉淀。浓度过高出现盐析。酸碱度：pH69*酸凝集：当 pH 为 3 左右时，接近细菌 Ag 的等电点，可出现非特异性凝集。蛋白质具有两性电离性质，每种都有固定的等电点。反应液中 pH 过高或过低都可影响抗原或抗体的理化性质。温度：1540，冷凝集为 4。在一定范围内，温度增高，分子运动加快，反应速度加快，但结合不牢固，易解离；温度低，反应速度慢，但结合牢固。6 抗原抗体反应的类型。沉淀反应；凝集反应；补体参与的反应；中和反应；免疫标记2 免疫原和抗体的制备（免疫原和抗
8、血清的制备；单克隆抗体与基因工程）1 免疫原是诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的物质。半抗原是指仅有抗原性而无免疫原性的物质，与载体结合后可具有免疫原性。2 特异性 IgG 抗体的纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法等；制备单价特异性抗血清可采用亲和层析法和吸附剂方法。1 可溶性免疫原制备：粗提组织匀浆制备，细胞的破碎2 可溶性免疫原提纯：超速离心法，选择性沉淀法，凝胶层析法，离子交换层析法，亲和层析法，电泳法1 多克隆抗体的概念由多种抗原决定簇刺激多株 B 细胞增殖分化所产生的抗体，是多种抗体的混合物。抗血清是经过抗原免疫的动物血清。在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内
9、多个 B 细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体。2 多克隆抗体的制备流程；免疫原(及佐剂)的制备；免疫动物（动物选择和动物免疫） ；试血；采血收集血清；抗血清的鉴定；抗血清的纯化；抗血清的保存3 免疫佐剂的概念、常见种类及作用机制。免疫佐剂是先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型的物质。氢氧化铝，明矾，弗氏佐剂(Freund adjuvant)，脂质体，细胞因子（乳化方式：研磨法：易乳化，但抗原或佐剂用量大。搅拌混合法：无菌操作，节省抗原或佐剂，但不易乳化完全）作用机制：1.改变抗原的物理性状，使抗原在体内滞留或延缓释放，
10、延长抗原与免疫细胞作用的时间，从而增强抗原免疫原性。2.抗原在佐剂的辅助作用下，更易被巨噬细胞有效吞噬和有效的加工处理和呈递。3.刺激单核巨噬细胞活化，释放细胞因子调节和增强淋巴细胞的应答能力。4.刺激淋巴细胞增生分化，从而增强和扩大免疫应答能力。应用佐剂的缺点：佐剂常混有微量其它物质，这些物质进入体内后也可引起抗体的产主，影响抗血清的特异性；注射佐剂可引起局部形成肉芽肿和无菌性脓肿；反复注射，易发生超敏反应，使局部组织坏死，甚至引起动物死亡。4 免疫血清制备动物的选择 1.抗原与免疫动物种属差异越远越好； 2.动物个体选择: 适龄、健壮、无感染正常动物、体重合乎要求；3.抗原性质:酶类豚鼠；
11、甾体激素家兔4.血清用途: R 型:等价带宽,适于诊断试剂.用家兔免疫产生. H 型:等价带窄,适于免疫治疗.用马免疫产生.5.抗血清需要量选择免疫方法 1.免疫剂量：1)不能过大或过小，否则产生免疫耐受；2)首次免疫剂量不宜过大 3)大:0.5-1mg/只 小:0.1-0.6mg/只免疫途径:1）皮内或皮下注射： a.采用多点注射(8-10 点)；b.半抗原宜皮内多点注射；c.皮内注射易引起细胞反应，对提高抗体效价有利，但皮内注射较困难(因佐剂加入后粘度大)。2）腹腔和静脉注射:多用于颗粒性抗原和加强免疫。3）淋巴结内注射:适宜于微量抗原(先用完全佐剂在足掌作基础免疫)。免疫时间：1）间隔约
12、 10-20 天（宜长、否则导致免疫耐受） ；2）二次以后每次间隔 710 天（过长刺激变弱 抗体效价不高。 ）3)一般接种 5-8 次，不超过 2 个月；4)半抗原的免疫间隔要求较长(3040 天)。如 8 次免疫后仍不产生抗体，则应更换动物。 采血及试血颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊；心脏采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、鸡 ；静脉采血法： 家兔、山羊、绵羊 免疫血清的纯化：免疫血清是成分复杂的混合物，除有特异性和非特异性抗体，还有各种蛋白成分抗血清硫酸铵盐析多次（粗提）亲和层析，离子交换层析，凝胶过滤IgG 类抗体（不纯）亲和层析，吸附法特异性 IgG 抗体抗体的鉴定：1.效价的鉴定：抗体含量
13、测定。 根据抗原性质不同，颗粒性抗原可采用凝集试验。可溶性抗原常用免疫双扩散法 2 抗体的纯度鉴定： SDS-PAGE。若只出现一条蛋白电泳区带说明抗体纯化已达到要求，而出现多条蛋白区带则表明抗血清中混有杂蛋白，必须进一步纯化。 3.特异性鉴定：抗体对相应或相似抗原识别能力 一般用特异性抗原及其相似的抗原与待鉴定抗体进行免疫双扩散试验。如果出现交叉反应，说明有杂抗体存在。可应用相应抗原吸收杂抗体，即可得到单价特异性抗体。4 抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好:亲和力测定主要有平衡透析法、酶联免疫法和放射分析法。亲和力的高低是由抗原分子和抗体分子的结合位点、抗原决定簇之间立体构型的合适度决定的。
14、免疫血清的保存：1.4保存：可保存 36 个月 2.低温保存：-20-40，可保存 23 年。抗体的保存浓度为 2030mg/ml 为宜，加入 1/10000 的硫柳汞或 1/1000 的叠氮钠防腐，并加入等体积的中性甘油，分装小瓶，置-20以下低温保存。 3.冰冻干燥保存：可保存 510 年4 单克隆抗体的概念每一克隆 B 细胞所产生的理化性状高度均一、组成均一、只与同一种抗原决定族反应的抗体。5 淋巴杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术：在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏 B 细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为 B 细胞杂交瘤。6 单克隆抗体的制备流程1、亲本细胞的选择
15、（骨髓瘤细胞：BALB/C 小鼠骨髓瘤 NS-1 细胞株和 SP2/0 细胞株，致敏 B 细胞：免疫脾细胞，每次抗原用量 100g）2、细胞融合（细胞融合剂PEG 种类:分子量 1000、1500、4000 的PEG 是最常用的细胞融合剂；作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合；作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的 PEG，其纯度与毒性有所不同。 ）3、杂交瘤细胞的选择性培养基，筛选与克隆化3 凝集反应1 凝集反应的原理及特点；定义：细菌和红细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原的颗粒性载体与相应抗体结合后，可出现肉眼可见的凝集现象。概念：颗粒性抗原 + 相应
16、抗体 (适量电解质)凝集现象，可溶性抗原（或抗体 ) + 载体颗粒 致敏颗粒+相应抗体（或抗原）(适量电解质)凝集现象特点：1.抗原为颗粒性抗原或可溶性抗原致敏颗粒；2.反应时间较短，需几到十几分钟；3.反应产物为凝集块；4.凝集反应抗原分子大，反应面积小，为使抗体分子不致过多，试验时需稀释抗体 。2 常见的直接凝集反应；直接凝集试验：颗粒性抗原在有电解质的参与下，直接与相应抗体结合出现的凝集现象。 凝集原(agglutinogen)：凝集反应中的抗原 凝集素(agglutinin)：凝集参与反应的抗体分类：玻片凝集实验（将已知抗体与待测颗粒抗原直接低价在玻片上，混匀并在室温下反应数分钟，用肉眼或低倍镜观察有无凝集现象，出现颗粒凝集的为阳性反应。方法评价：简便、快速；定性检测方法； 但敏感性较低。临床应用：主要用于菌种鉴定和血清学分型，也可检测病人血清中有无相应的抗
