制备色谱分离技术及实际应用

《制备色谱分离技术及实际应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《制备色谱分离技术及实际应用（132页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、制备色谱分离技术及实际应用 Contents 概述 色谱 Chromatography 色谱 这一术语是根据 Chromatography 一词翻译而来的 它是由俄国植物学家茨维特 Tsweet 于1903年首创的 是由一个实验而得名 后来扩展到纸色谱 薄层色谱 电泳 逆流色谱等不同形式的色谱 色谱 Chromatography 色谱法是一种物理化学分析方法 根据所用样品混合物中各组分物理 化学性质的差异 各组分在互不混溶的两相之间分配 吸附 分子亲和力等行为存在差异 当两相相对运动时 各组分在两相中反复多次重新分配 结果使混合物得到分离 色谱法是一种从混合物中分离组分的方法 色谱法能分离物理

2、化学性质差异很小的用其他方法很难分离的化合物 填充剂由碳酸钙发展到硅胶 离子交换树脂 凝胶等 流动相也出现了气相 超临界流体流动相 分离的规模也从实验室毫克到了以吨计的工业规模 色谱技术在中药中的应用已经日趋重要 其中尤以大孔吸附树脂 离子交换色谱 硅胶色谱等的应用最为广泛 在人参皂苷 绞股蓝皂苷 甜菊苷等多种中药的单方 复方 有效部位 有效成分等的生产中得到广泛应用 成为分离纯化的重要手段 第一节概述 一 制备色谱简介利用各待分离组分在相间的吸附 分配系数的差异 离子交换平衡值的区别等 使得各组分在相间滞留时间不同而进行分离 从而制得所需产品 大型制备色谱 吨计 微型制备色谱 克 毫克二 色

3、谱分离原理及特点 利用各组分在互不混溶的两相之间分配 吸附 分子亲和力等行为的差异 并通过两相不断的相对移动而实现分离的方法的总称 互不混溶的两相分别是固定相 stationaryphase 表面积很大或多孔性固体 和流动相 mobilephase 展开剂 液相或气相 下图是分离机理过程的模型 图6 2 与其他分离技术如萃取 蒸馏等相比 色谱法具有高超分离能力和效率 其特点主要如下 1 分离效率高 分析出较复杂的样品 2 灵敏度高 可以检测出10 13g级的物质 3 分析速度快 几分钟 几十分钟 4 应用范围广 有机 无机 低分子或高分子等 色谱法的特点 三 色谱的分类 1 按流动相和固定相的

4、状态分类 3 超临界流体色谱 2 按分离机理分类 1 吸附色谱法是利用组分在吸附剂 固定相 上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法 组分与吸附剂之间的作用力主要为分子间力 与两者的极性有关 2 分配色谱法利用各个被分离组分在固定相和移动相两相之间分配系数的不同而进行分离的过程 分配色谱主要根据物质在两相中的溶解度差异而实现 固定相为涂渍有固定液 液体 的多孔惰性载体 硅胶 硅藻土 聚合物 纤维素粉 滤纸 若采用极性较大的相为固定相 极性较小的相为流动相 则称为正相色谱 相反 则称为反相色谱 实践中有70 以上都采用反相色谱 表6 2正相和反相色谱中流动相极性的关系 2 按分离机理分类 6 聚焦色

5、谱法利用具有两性电解质特点的组分如氨基酸和蛋白质 酶等在等电点上的差异 当混合物流经具有pH梯度的固定相时 各组分在相应的等电点上进行聚焦而达到分离的目的 疏水作用色谱利用蛋白质表面在非变性状态下容易与非极性物质相互作用的性质 从而将溶解性不同的蛋白质得以分离 上述方法主要用于两性电解质或蛋白质的分离纯化 2 按分离机理分类 3 按固定相的外形分类 柱色谱 固定相装于柱内的色谱法 可分为填充柱色谱法和开管柱色谱法 平板色谱 固定相呈平板状的色谱 它又可分为薄层色谱和纸色谱 4 按色谱动力学分类 洗脱法 又称淋洗法 如将3组分的样品注入色谱法 流动相连续流过色谱 并携带样品组分在柱内向前移动 经

6、色谱分离后 样品中不同组分依据与固定相和流动相相互作用的差别 而顺序流出色谱柱 前沿法 又称迎头法 如将含3个等量组分的样品溶于流动相中 组成混合物溶液 并连续注入色谱柱 此法仅第一个组分纯度较高 置换法 又称顶替法 待分离混合物样品与固定相有强作用力 因此需使用一种比样品组分与固定相间作用力更强的置换剂做流动相 当它注入色谱柱后 可迫使滞留在柱上的各个组分依次洗脱下来 5 按使用领域不同对色谱仪的分类 分析用色谱仪 这类色谱仪主要用于各种样品的分析 其特点是色谱柱较细 分析的样品量少 制备用色谱仪 制备用色谱仪又可分为实验室用制备型色谱仪和工业用大型制造纯物质的制备色谱仪 流程色谱仪 流程色

7、谱仪在工业生产流程中为在线连续使用的色谱仪 四 色谱法中常用的术语与参数 色谱图 各组分经色谱柱分离后 从柱后流出进入检测器 检测器将各组分浓度 或质量 的变化转换为电压 或电流 信号 再由记录仪记录下来 所得的电信号强度随时间变化的曲线 称为流出曲线 也叫色谱图 1 区域宽度 1 标准偏差 W1的一半叫标准差 即0 607峰高处色谱峰宽的一半 半峰宽W1 2 即峰高一半处对应的峰宽 它与标准偏差的关系为W1 2 2 354 峰底宽度Wb 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离 它与标准偏差的关系为Wb 4 W1 Wb 2 保留值 保留值是各组分自色谱柱中滞留的数值 通常包括时间 距离及

8、各组分流出色谱柱所需要的流动相的体积等参数 1 保留时间 保留时间 retentiontime tR 从进样到柱后某个组分出现浓度极大值的时间 死时间 deadtime t0 不保留组分的保留时间 即流动相通过色谱柱的时间 调整保留时间 adjustedretentiontime tR 扣除死时间后的保留时间 2 保留体积 保留体积 retentionvolume VR 从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积 又称为洗脱体积 VR tRFc死体积 deadvolume V0 由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间 它包括4部分 进样器至色谱柱管路体积 柱内固定相颗粒

9、间隙 被流动相占据 Vm 柱出口管路体积 检测器流动池体积 其中只有Vm参与色谱平衡过程 其它3部分只起峰扩展作用 为防止峰扩展 这3部分体积应尽量减小 V0 t0Fc调整保留体积 adjustedretentionvolume VR 扣除死体积后的保留体积 VR VR V0 tR Fc 3 分配系数 样品在固定相和流动相中的分离达平衡时 Cs 固定相浓度 和Cm 流动相的浓度 的比值为平衡系数K Cs Cm在各种色谱中K的表示方法有区别 分配色谱 K为分配系数表示为 对吸附色谱而言K为吸附系数 表示为 4 容量因子 在两相分配达平衡时 物质在两相的量的比为容量因子 或分配容量 容量比 质量分

10、配系数 物理意义 表示一个组分在固定相中停留的时间是不保留组分保留时间 t0 的几倍 k 0时 化合物全部存在于流动相中 在固定相中不保留 tR 0 K越大 说明固定相对此组分的容量越大 出柱慢 保留时间越长 5 选择性因子 选择性因子 selectivityfactor 为相邻两组分分配系数或容量因子之比 它可以表示为 要使两组分得到分离 必须使 1 与化合物在固定相和流动相中的分配性质 柱温有关 与柱尺寸 流速 填充情况无关 从本质上说 的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异 即分子间相互作用力的差异 五 色谱法的基本理论 一 塔板理论 塔板理论认为溶质在色谱柱内的一次分配平衡

11、 需要在一定的柱高内完成 通常将这段色谱柱称为一个理论板 theoreticalplate 其高度称为理论塔板当量高度H heightequivalenttoatheoreticalplate HETP 或塔板高度 色谱柱中存在着许多塔板 塔板理论的基本假设为 1 样品的各组分都加在第0号塔板上 样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略 2 流动相是间歇式进入色谱柱 每次进入一个塔板体积 3 在所有塔板上分配系数相等 与组分的量无关 设高度为L的色谱柱的理论板数为N 则 单位长度的柱内塔板数越多则柱效越高 保留时间 峰底宽 二 速率理论 速率方程 也称范 弟姆特方程式 H A B u C uH 理论塔

12、板高度 u 载气的线速度 cm s 减小A B C三项可提高柱效 存在着最佳流速 A B C三项各与哪些因素有关 1 涡流扩散项 A A 2 dpdp 固定相的平均颗粒直径 固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒越小dp 填充的越均匀 A H 柱效n 表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻 色谱峰较窄 2 分子扩散项 B B 2 Dg 弯曲因子 填充柱色谱 1 Dg 试样组分分子在气相中的扩散系数 cm2 s 1 由于柱中存在着浓度差 产生纵向扩散 a 扩散导致色谱峰变宽 H n 分离变差 b 分子扩散项与流速有关 流速 滞留时间 扩散 c 扩散系数 Dg M载气 1 2 M载气 B值 3 传质

13、阻力项 C 组分在气相和液相两相间进行反复分配时 遇到阻力 传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL 液相传质阻力大于气相传质阻力 即 C Cg CL 4 载气流速与柱效 最佳流速 载气流速高时 传质阻力项是影响柱效的主要因素 随着流速的提高 柱效下降 右图曲线的右边 载气流速低时 H u曲线与最佳流速 由于流速对这两项完全相反的作用 流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值 即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值 以塔板高度H对应载气流速u作图 曲线最低点的流速即为最佳流速 分子扩散项成为影响柱效的主要因素 随着流速的增加 柱效提高 右图曲线的坐边 5 分离度 塔板理论和速

14、率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度 即柱效为多大时 相邻两组份能够被完全分离 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响 保留值之差 色谱过程的热力学因素 区域宽度 色谱过程的动力学因素 色谱分离中的四种情况如图所示 柱效较高 K 分配系数 较大 完全分离 K不是很大 柱效较高 峰较窄 基本上完全分离 柱效较低 K较大 但分离的不好 K小 柱效低 分离效果更差 分离度的表达式 R 0 8 两峰的分离程度可达89 R 1 0 分离程度98 R 1 5 达99 7 相邻两峰完全分离的标准 提高分离度有以下三种途径 增加塔板数 增加柱长或降低塔板高度 增加选择性 改变流动相的组成

15、及pH改变柱温改变固定相改变容量因子 可通过调节流动相的组成来实现 第一节制备薄层色谱分离技术 制备色谱是指以色谱为手段从混合物中分离提纯所需要的纯化合物 主要技术有薄层色谱 离心薄层 快速薄层制备柱色谱 干柱色谱 真空液相色谱 压力液相色谱 逆流色谱等 一 薄层色谱条件 固定相的选择在制备色谱中应用较多的是以吸附剂为固定相的吸附色谱 固定相的选择应从被分离物质极性和固定相的性能的强弱这两方面考虑 常用吸附剂简介 1 硅胶 SiO2xH2O是一种极性吸附剂 微带酸性 适用于酸性物质及中性物质的分离 硅胶的吸附活性与其表面吸附的水的量有关 硅胶表面存在硅醇基 通过氢键与极性化合物结合 用于分离有

16、机物 也可通过氢键与水结合 当吸水大于12 时 则失去活性或吸附性 不能用作吸附色谱 只能用作分配色谱的载体 但加热到100 左右 此结合水能被可逆地除去 硅胶又恢复吸附能力 我们在制备薄层板后需进行活化 即为此目的 硅胶的分离效率取决于其颗粒大小和粒度分布范围 颗粒大范围宽效果差 但是展开快 斑点分散 荧光硅胶 在硅胶中加入荧光剂 制成的薄层在紫外光照射下显荧光 而样品斑点处不显荧光 呈暗色 从而可检出斑点位置 这适用于那些本身无色 在紫外灯下也不显荧光 又无适当显色剂显色的化合物 荧光硅胶两种 波长254nm和波长为365nm GF254 GF365 HF365 HF254等 硅胶可用于吸附色谱 也可用于分配色谱 主要区别在于活化程度不同 前者活化程度较高 后者低得多 反相硅胶 当硅胶表面的羟基被部分烷基化时 称反相硅胶 其对物质吸附性恰好相反 对弱极性的物质具有吸附性 相似相容 用反相硅胶分离效果会大大提高 和正相相反 反相色谱常常被用于从极性溶液中或水相中分离非极性物质 非极性物质通过非极性官能团与固定相的相互作用被吸附在固定相的表面 一个非极性更大的溶剂将分析物从固定相上洗脱